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今天跟大家分享的是2020年1月发表在Journal of Cellular Physiology(IF=4.522)杂志上的一篇文章The chromosome 19 microRNA cluster, regulated by promoter hypomethylation, is associated with tumour burden and poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma。在文章中作者受19号染色体microRNA簇是最大的miRNA簇的启发，研究了19号染色体microRNA簇受启动子低甲基化调节与肝细胞癌患者的肿瘤负荷和不良预后之间的关系。
The chromosome 19 microRNA cluster, regulated by promoter hypomethylation, is associated with tumour burden and poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma19号染色体microRNA簇受启动子低甲基化调节，与肝细胞癌患者的肿瘤负荷和不良预后有关
一. 研究背景
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)仍然是预后不良的主要恶性肿瘤之一，也是发展中国家癌症死亡的主要原因之一，少数患者受益于各种外科手术治疗和靶向辅助治疗。但是，由于缺乏临床表现，导致肿瘤进展，HCC的预后仍然有限，因此，至关重要的是更好地了解HCC相关分子机制，以发现有效的诊断标准和治疗方法。即使在体内或体外证实了单个miRNA的作用，也可能太弱而无法逆转肿瘤微环境中的肿瘤发生和肿瘤进展，因此，本文就致力于探索与肿瘤相关途径协同作用的miRNA。
19号染色体microRNA簇(C19MC)是最大的miRNA簇，具有59个成熟miRNA的高产量。其功能和调控机制在HCC中尚不清楚。而且，由两个或多个miRNA组成的miRNA簇不仅对其相邻的蛋白质编码基因具有特异性，而且还可能具有共同的功能。为此，作者提出两个假设：
一方面，有一种统一的方法来调节C19MC中所有miRNA的表达，另一方面，C19MC miRNA可能对HCC具有惊人的显著影响。
二. 分析流程
分析流程
三. 结果解读
1. C19MC在肝癌中表现出全面而持续的高miRNA表达水平。
从TCGA获得了373个HCC和50个非肿瘤样品的总miRNA图谱。在使用edgeR包进行统计分析后，筛选出基于其表达水平的倍数变化值(fold‐change values)差异表达的miRNA。得到C19MC表达的46个miRNA的信息。
发现位于C19MC中的所有46个miRNA与非肿瘤样品相比，均显示出高和正的倍数变化值(图1a)；之后提取数据应用可视化无监督分层聚类来评估C19MC miRNA的差异表达，结果表明HCC样品中C19MC miRNA的表达水平高于非肿瘤样品(图1b)。
图1. C19MC miRNA在HCC中始终显示高表达水平
2. C19MC miRNA的表达水平与启动子低甲基化有关
为了探索触发C19MC miRNA特异性上调的机制，作者评估了C19MC启动子的甲基化水平以及甲基化与表达水平之间的相关性。使用了来自TCGA的甲基化数据，并获得了C19MC启动子相关CpG的β值进行分析。
得到来自50个非肿瘤样本和373个HCC样本的C19MC甲基化水平的热图。颜色代表甲基化水平，范围从0到1(图2a)。之后，进一步确定了每种miRNA差异表达的影响。结果表明在HCC样品中所有C19MC启动子的甲基化水平均显着降低且均一降低，证明HCC样品中C19MC基因表达高(图2b)。
图2. 启动子低甲基化上调了C19MC的表达
3. C19MC的高表达水平与组织病理学特征和存活率相关
鉴于C19MC miRNA的所有表达水平在HCC中普遍上调，作者进一步旨在检测这些miRNA的表达是否与HCC患者的组织病理学特征和生存率相关。使用Mann-Whitney检验进行统计分析，结果表明，T期高的HCC显示出C19MC miRNA高表达水平的统一趋势。其中，T分为低T阶段和高T阶段，一般代表原发部位肿瘤的大小(肿瘤负荷)。在肝癌T期中，C19MC miRNA表达水平与较好预后有关。
图3. T期C19MC miRNA表达水平有较好预后
图3的结果，促使作者评估C19MC与患者预后之间的关系。在所有46种miRNA中，高表达的3种miRNA（mir-512-1，mir-516a-1和mir-519a-2）与更差的OS相关(图4a)。进行Kaplan-Meier生存分析，其中将三个miRNA表达水平的中位数设置为临界值。
图4a. 在mir-512-1，mir-516a-1和mir-519a-2表达水平与较好预后有关
森林图描绘了使用临床特征和三种miRNA的表达水平进行生存的单变量分析，结果表明T期，高表达的mir-512-1和mir-516a-1与更差的OS显著相关(图4b)。点表示危险比，误差线表示95％置信区间的值。
图4b. 临床特征和三种miRNA的表达水平生存的单变量分析结果
ROC曲线评估了三种mRNA标记的敏感性和特异性。使用T期作为预后模型，AUC为0.728(左)。加入三种miRNA的标记后，AUC升至0.76(右)。结果表明，高表达的三种miRNA与更差的OS显著相关(图4c)
图4c. 三种mRNA标记的敏感性和特异性的评估
4. 三种miRNA的靶基因预测和功能分析
mir-512-1(左)，mir-516a-1(中)和miR-519a-2(右)从TargetScan(蓝色)，miRWalk(绿色)和miRDB(红色)三个数据库预测重叠靶基因，并用基因通过R的Venny包进行筛选和可视化(图5a)。
图5a. 预测靶基因的重叠部分
为了进行生物信息学分析并探索miRNA标记的潜在机制，作者进一步收紧了3个miRNA的靶基因的重叠——mir-512-1(红色)，mir-516a-1(绿色)和mir-519a-2(蓝色)靶基因进一步重叠。结果表明，共有196个基因可能是3个miRNA的共同靶基因(图5b)。
图5b. 三个mRNA的共同靶基因
为了对miRNA标记进行蛋白质间相互作用分析，我们将196个基因上传到了STRING，蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，在已构建的PPI网络中确定了31个置信度最高的重要节点(图5c)。
图5c. 蛋白质-蛋白质相互作用分析(PPI)
5. 对靶基因进行GO富集和KEGG途径的生物信息功能分析
用DAVID数据库分析和可视化GO注释和潜在途径。作者在GO中提交了图5b中的196个常见基因，分了三个域(domain)：生物过程，细胞成分和分子功能。结果表明，靶基因的功能与信号转导、蛋白结合、转录调节、蛋白磷酸化和MAPK途径有关，并显示了每个域的前十项(图6a)。
图6a. 常见基因在三个域中的分析
KEGG分析得出的与癌症相关的途径(表1)。
表1. KEGG预测基因的癌症相关途径
鉴于MAPK途径与靶基因的KEGG(表1)，GO(图6a)和PPI分析(图5c)相关，作者进一步分析了MAPK涉及的6个靶基因的功能。结果表明，HCC样品中的三种基因MAP3K2，MAP2K4和MAPK10(促分裂原激活的蛋白激酶10)的表达水平下调(图6b)。
图6b. HCC中三个潜在靶基因的表达水平
这三个关键靶基因顺序位于c-Jun N-末端激酶(JNK)轴，这是MAPK途径中的关键轴。结果强烈表明这三种miRNA可能促进了通过抑制JNK轴的功能来侵袭HCC，从而影响HCC的预后(图6c)。红色箭头表示潜在的靶向抑制，其中虚线表示较弱抑制，实线较强抑制。
图6c. 靶向MAPK途径中JNK轴的三个miRNA的示意图
本文作者通过说明C19MC在HCC中的一系列影响，得出C19MC可以成为诊断和治疗HCC的有力靶标这一结论。还是和往常一样，后台回复「17a」，即可获取今天小编为大家解读的文献。
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