全基因组扩增技术

2021/03/09

全基因组扩增技术 Whole Genome Amplification，WGA

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DOP-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR，简并寡核苷酸引物PCR)

  使用由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库

1、基本原理：

  根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库，在引物中有越多的Y或R或N,引物的简并程度就越大。

2、引物设计条件：

  两端保守的氨基酸序列或DNA序列（保守性不必为100%，保守氨基酸区段最好不要以丝氨酸，精氨酸和亮氨酸为主）
  蛋白N端序列已知

3、尽量降低引物简并性程度（1,000~10,000之间）

  选择最佳引物位点
  用次黄嘌呤作为“中和”碱基（C、T、A）
  在同一位置分别使用多个寡核苷酸引物库
  在引物末端要用密码子的共同碱基序列
  应用密码子的偏性

4、设计软件

  Primo Degenerate3.4、Genefisher、CODEHOP、Simple Degenerate Primer

LM-PCR(ligation-mediated pcr amplification，连接反应介导的PCR扩增)

PEP-PCR(primer extension preamplification（PEP），扩增前引物延伸法)

  引物是由15个核苷酸组成的完全随机引物，PCR由50个循环组成，每个循环的退火温度都是由37℃连续升温到55℃，从而确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，使整个基因组扩增。

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MDA Multiple Displacement Amplification, 多重置换扩增

  基于链替代扩增法（等温滚环扩增技术）建立
  引物六聚体（6个随机核苷酸）在多个位点与模板DNA退火，phi29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，沿着DNA模板合成DNA，同时取代模板的互补链，被置换的互补链成为新的模板进行扩增。

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Digital-WGS

  通过湿润的流体动力学结构为任何数量和类型的细胞提供了高单细胞捕获效率。
1、可寻址的液滴操纵
2、DMF（Digital microfluidics，数字微流体）芯片上局部湿润的水动力结构
Digital-WGS在多个方面都优于现有的MDA方法，从而大大降低了放大偏差和指数放大误差。能够以最小的150 kb bin和等位基因剔除率（ADO）为5.2％的单核苷酸变体（SNV）实现出色的CNV检测。

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MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，多次退火环状循环扩增技术)

MALBAC.png
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MALBAC技术优势：
  降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。
  灵敏度高：单细胞、单染色体或0.5pg的基因组DNA即可进行扩增。
  扩增均匀性显著优于其它技术。
  扩增产物用途广泛：可用于二代测序、微阵列、qPCR、基因克隆。

  目前，MALBAC技术现在已经成功应用于人类单精子、植入前产前筛查的囊胚和极体、早期发育胚胎、肿瘤细胞、刑侦现场痕量物证和部分微生物。
适用条件：
1、样本稀少，用常规方法无法进行基因组或转录组分析
  癌症研究（穿刺取样、肿瘤循环细胞CTC、激光微切割组织）
   胚胎研究（早期胚胎发育，体外受精植入前筛查）
  法医、古生物、干细胞
2、样本高度异质， 细胞之中存在重要差异
  肿瘤遗传异质性、神经元、辐射前后细胞
  生殖细胞（不孕不育研究、人类精子重组位点分析与染色体异常检测、花粉细胞遗传重组）
from:
Probing Meiotic Recombination andAneuploidy of Single Sperm Cells by Whole-Genome Sequencing.
期刊：Science (New York, N.Y.)
DOI ：10.1126/science.1229112
日期：2012-12-21