视频10：单细胞DNA测序

要克服的困难

• （1）随机引物PCR扩增，由于扩增效率不同，则扩增不均一；
• （2）全基因组覆盖问题：常规的打断，加接头等操作会损失DNA，这是不可接受的，这里要求几乎所有的原始DNA都要被扩增并且检测到。
• （3）要有较高的扩增效率：普通的方法，2万个文库，只有一个会被结合在flowcell上。

MALBAC方法的原理，和其巧妙之处

MALBAC方法

• 扩增引物的5’端有27个碱基的通用序列，这些通用序列会作为未来的PCR通用扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基，这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。
• Phi 29 DNA聚合酶有一个特点，它不仅可以生成新的DNA链，它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。
• 每个循环的最后，加了一步58度退火，这一退火过程，它让完整扩增的产物，它的两端发生链内杂交。这样，3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交。这也就不会引新的、发起始于3’端的扩增
• 这样，就避免了完整扩整的产物的自我指数扩增。
• 8个随机序列的引物在模板上随机地找结合位置，所有的位点都有一样的机会被扩增。
• Phi 29聚合酶的能一次在模板上聚合出多个新链
  • 均一性更好，扩增效率相对较低

MDA方法的原理

• 技术核心是用Phi 29 DNA聚合酶来进行直接的扩增。
  

  MDA方法

• Phi 29酶的特点是，它可以把双链DNA进行解链，然后，在常温条件下，就把原始模板进行大量扩增。

• 扩增效率高，简单

单细胞测序在胚胎植入前检测中的应用

• 胚胎植入前进行基因拷贝数变异检测。
• 在受精卵发育到8个细胞的时侯，通过显微操作，抓一个细胞出来进行测序
• 肿瘤的染色体变异研究。