小麦秆锈病（Puccinia graminis f.sp. tritici (Pgt)） 是一类重要的世界性小麦病。欧美国家自1950年以来陆续采用了消除可变寄主（Berberis vulgaris，秆锈病的寄主之一。秆锈病是交替寄生真菌）和培育抗性小麦的方式控制了秆锈病。但是南非和澳大利亚却没有幸免于难。直到99年在乌干达的小麦中定位到了基因Sr31，秆锈病抗性基因随后便被克隆。被基因Sr31干翻的菌株也青史留名：Ug99。然鹅病原菌并没有躺平等死，而是不断进化，不光战胜了Sr31，而且克服了更多秆锈病抗性基因（例如，Sr24 and Sr36）。由此可见，挖掘新的广谱秆锈病抗性基因刻不容缓。
首先隆重介绍本次励志故事的嘉宾：Puccinia graminis f.sp. tritici
小麦秆锈病菌株Ug99发病部位病斑
文章信息
- 题目：Aegilops sharonensis genome-assisted identificationof stem rust resistance gene Sr62
- 期刊和时间：Nature Communications，2022.3.25
- 作者和单位：通讯作者是来自英国约翰英纳斯中心/沙特阿卜杜拉国王科技大学的Brande B. H. Wulff教授。
主要结果
- 组装了二倍体小麦亲缘种Aegilops sharonensis的高质量基因组。
- 利用正向和反向遗传学方法鉴定了秆锈病抗性基因Sr62，并验证其功能。
研究结果
Aegilops sharonensis（Ae. sharonensis） 是二倍体小麦的祖先之一，其含有众多抗性位点，被众多研究报道过。但是其基因组中还存在另一种扼杀配子体的基因，导致其无法与普通小麦进行基因渗入。因此。Ae. sharonensis的遗传潜力巨大且亟待开发。
Aegilops sharonensis
1.Aegilops sharonensis基因组组装
作者使用了先前报道过抗性基因的的Ae. sharonensis品种AS_1644进行测序。测序策略如下：
这里作者提到了“mate-pair”方法。mate-pair方法基于长片段文库(1000-10,000 bp)，由配体结合到序列的adaptor上进行双端测序。
Flow chart depicting the strategy for sequencing and assembly
of Aegilops sharonensis accession 1644
随后对组装后的基因组进行评估，基因组完整性采用 BUSCO进行评估。基因组组装情况及评估结果如下（table1）:
table1|Aegilops sharonensis AS_1644基因组组装情况
2.抗性基因Sr62的定位
这一步应当是这篇文章费时最多的一步，也是本文的核心工作：QTL mapping。作者利用抗性Aegilops sharonensis株系1644与感病株系2189进行杂交，并且在染色体1Ssh上定位到了抗性基因Sr62，同时在染色体 5Ssh上定位到了抗性基因Sr1644-5Sh。为了分离这俩基因，作者测序了子三代家族的植物并且鉴定到了803株系，其Sr62位点杂合，Sr1644-5Sh位点纯合。以803株系为基准继续自交4代最终分离了抗性基因Sr62和抗性基因Sr1644-5Sh。后继通过精细定位绘制了Sr62物理图谱和遗传图谱（Fig1）。
Figure1|Sr62物理图谱和遗传图谱
注解：图a是小麦和Ae. sharonensis在染色体1Ssh的易位。b是Sr62的遗传图谱。c是Sr62的物理图谱。d图作者进行了RNAseq给精细定位出的Sr62物理图谱内加基因注释。
3.通过EMS诱变和RNA-seq确定Sr62候选基因
在刚刚的RNA-seq中作者得到了Sr62所在区域众多候选基因及其注释，于是作者采用EMS诱变的方式，对小麦B和D染色体渗入Aegilops sharonensis染色体1Ssh的株系进行EMS诱变，选取M2株系接种Ug99观察抗病表型。得到了14株感病表型株系。随后作者利用RNAseq分别测定了1644和14株感病表型株系的转录本（Fig2），最终在WTK5基因鉴定到了八个点突变，其中七个是非同义突变，一个是无义突变（Fig3a，b）。
Figure2|Candidate gene identification by mutagenesis and transcriptome
sequencing
在这里作者还自行拓展了一个公式用以确定EMS诱变法定位基因所需要的最小突变体个数，有兴趣的朋友可以自行查阅原文。之后，作者克隆了WTK5（Sr62）(Fig3c)用以进行转基因小麦表型验证。经过转基因操作，作者得到了三株转基因小麦，其中两株含有Sr62单拷贝一株含有Sr62四拷贝。分别接种四种菌株验证Sr62抗性表型（fig3d）。
Figure3| QTLmapping到的Sr62抗性基因的突变位点及其转基因小麦的抗病表型
注解：Fig3a是EMS中检测到的Sr62突变核苷酸位点的突变方式。符合G/C-to-A/T的EMS典型诱变模式。Fig3b是a对应过来的氨基酸变化模式，七个非同义突变，一个无义突变。c图是Sr62基因克隆得到的序列。d图是Sr62转基因水稻接种实验表型。
4.Sr62系统发育与同线性分析
Sr62包含两个必要的激酶结构域，为了探索其与其他串联激酶的序列关系，作者选择了一系列作物与其构建系统发育关系。那么如何找到其他作物中的串联激酶呢？作者采用了blast方法，检索Sr62串联激酶的CDS区域序列。拥有2-3个串联重复激酶蛋白会被选择构建系统发育树。
Figure4| Sr62串联激酶系统发育树以及其单个激酶域建树。
Figure5| Sr62基因附近区域同线性分析
注解：以blast法找到了99个与Sr62相似的串联激酶蛋白。Fig4a针对其全串联激酶域建树，Fig4b针对其单独激酶域建树。Fig5绘制了各个作物中Sr62同源基因的连锁区域结构图
R基因在小麦中的定位与克隆较为复杂，传统图位克隆方法通常要经历构建分离群体（收集约1000株F2分离株系）—构建遗传图谱—构建物理图谱—候选基因分析—候选基因验证五个步骤。总共需要耗时5-7年。本文定位基因Sr62的过程非常完整地还原了传统图位克隆方法。
总结
先来说说这篇文章最为核心的卖点：图位克隆。杂交谱系的构建以及EMS诱变和转基因验证是本文工作量最大的部分，也是历时最长的部分。开头测序组装的Aegilops sharonensis基因组更像是定位完基因后做的补充，在QTL定位中用到的更多还是杂交群体的后代，而非高质量基因组。随后的系统发育和同线性分析都是常规的生信分析。
上一周分享了大豆多倍化和生活史转化的故事，启发了小编如何用六个基因组发上NP。今天这篇小麦族与秆锈病之间的免疫军备竞赛更为离谱，只用一个基因组就发上了NC。但是，与上一篇文章不同的是，这篇文章加入了正向遗传学实验，结合了实验和生信是自己的分析结果更具有说服力。可见，生物信息与实验如果配合得当，有时能相辅相成，让自己的文章嘎嘎上分。
参考信息：
1. Yu, G., Matny, O., Champouret, N. et al. Aegilops sharonensis genome-assisted identification of stem rust resistance gene Sr62. Nat Commun 13, 1607 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29132-8
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