今天跟大家分享的是2019年十二月份发表在frontiers in Oncology杂志上的一篇文章，文章主要以湿实验为主。
SMAD4 Somatic Mutations in Head and Neck Carcinoma Are Associated With Tumor Progression
头颈鳞状细胞癌中SMAD4 体细胞突变与肿瘤进展相关
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC），包括口腔鳞状细胞癌，是全球第六大最普遍的恶性肿瘤。 HNSCC的发病机制受许多分子因素的影响，TCGA的全外显子测序（WES）显示HNSCC中具有显著突变的新基因。
SMAD4是SMAD家族的转录因子，其参与TGF-β信号传导。在过去20年研究中发现仅SMAD4功能丧失并不能引发肿瘤，但可能会促进由其他分子缺陷（如KRas的激活）引发的肿瘤的进展。SMAD4的丧失在对DNA损伤的反应中起着至关重要的作用。
这项工作中，研究了HNSCC中的SMAD4突变。发现SMAD4的突变及其表达水平与HNSCC的进展有关，并影响患者的生存。
数据
122个手术切除的HNSCC样本（Mackay Memorial Hospital，中国台湾），术前均未接受放疗或辅助化疗。血液和癌组织中提取DNA。
结果
一、SMAD4的体细胞突变和LOH
1.为了评估SMAD4在临床患者中的表现，对122个HNSCC患者的SMAD4基因进行测序（NGS）和杂合性缺失（LOH）分析。在患者中识别到了SMAD4的7个体细胞突变，其中2个是同义突变，5个是错义突变（图1A,B）。在28(22.95%)个患者中，至少发现一个LOH标志（本工作使用三个接近SMAD4 位点的多态性标志：D18S363,D18S474和D18S46），17(13.93%)个患者中有2或3个LOH标志（图1A）。90个患者没有突变或LOH。
图1.HNSCC患者中SMAD4突变及LOH情况
2.相比淋巴结未转移患者，有淋巴结转移的患者的突变、LOH频率高（图2C）。在临床分级、肿瘤大小、嗜神经侵袭、淋巴血管渗透上没有显著区别（图2A-E）。对患者划分两组（SMAD4野生组、SMAD4突变或LOH或既突变又LOH组）进行生存分析，结果显示，有SMAD4突变或LOH的患者生存差（图2F-G）。COX回归分析显示SMAD4突变或LOH的患者有较差的DFS和OS（表1）。
图2.SMAD4 LOH和突变的临床/病理学参数比较及生存分析
表1.SMAD4 LOH和突变相关的COX回归分析
二、SMAD4在HNSCC患者中的表达
在癌旁正常口腔上皮细胞、肿瘤细胞中分别检测SMAD4表达（图3A），在肿瘤组织中，SMAD4的表达从弱到强不等。研究发现SMAD4低表达与临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移相关（图3B-G）。SMAD4的表达与LOH和突变状态、嗜神经侵袭和淋巴血管渗透无关。生存分析显示SMAD4低表达患者生存差（图3H，I）。但是多变量Cox回归分析显示，SMAD4表达与OS之间的相关性仅略显著。
图3.SMAD4 表达相关的临床/病理学参数比较及生存分析
三、SMAD4敲除与增加HNSCC侵袭能力的关联性
SMAD4在正常的人类口腔角质细胞（NOKs）和HNSCC细胞中的蛋白表达（图4A）。57.1%的HNSCC细胞系相比于NOKs有表达降低或者没有蛋白表达的情况。
为了进一步阐明SMAD4的致癌作用，在SAS和SCC25这两个HNSCC细胞系中敲除SMAD4（图4B），发现敲除SMAD4没有影响细胞增殖（图4C，F），但细胞迁移和入侵显著增加（图4D,E,G,H）。
图4.SMAD4 敲除相关分析
四、SMAD4突变与增加HNSCC侵袭能力的关联
为了表征SMAD4对表型的影响，从SAS细胞系中扩增出SMAD4的全长编码区，并克隆得到SMAD4结构体。在肿瘤样本中，SMAD4有三个错义突变 (p.His132Tyr,p.Pro296Thr, and p.Ala488Val)，这些突变分别位于MH1、Linker和MH2区域（图5A）。
在FaDu和 OECM1（没有或者只有低SMAD4表达）细胞系中构建SMAD4突变，湿实验研究SMAD4表达变化（图5B,C）。外源的SMAD4表达减少了FaDu和OECM1细胞系的迁移和入侵(图5E,F,H,I)。突变体p.H132Y被转染后，细胞系中由SMAD4过表达而抑制的表型消除了。转染的细胞系增殖率未被影响 (图5D,G)。然而，p.P296T和p.A488V突变体并没有消除SMAD4过表达对入侵和迁移的挽救作用。
图5.构建SMAD4突变型的表达相关分析
这篇文章的主要内容就是这些，让我们再来回顾一下整个研究。由于SMAD4的分子功能丧失与肿瘤密切相关，所以研究人员从该基因入手对122个HNSCC肿瘤进行分析，首先评估该基因在肿瘤中突变和LOH的情况，探究其与临床分级、肿瘤大小以及预后的关系，发现有SMAD4突变或LOH的患者生存差，同时生存分析显示SMAD4低表达患者生存差。接下来又对SMAD4进行敲除以及对细胞系构建突变体，发现敲除会影响细胞迁移和入侵，而不同突变体对入侵和迁移的影响不同。
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