今天跟大家分享的是十一月份发表在Aging杂志上的一篇文章，这是一篇关于利用WGCNA分析喉癌中lncRNA和mRNA的研究。
Characterization of long non-coding RNA and messenger RNA profiles in laryngeal cancer by weighted gene co-expression network analysis
利用加权基因共表达网络分析喉癌中的lncRNA和mRNA表达谱
喉癌（laryngeal cancer, LC）是头部和颈部区域的恶性肿瘤。最近发现lncRNA参与喉癌的发生发展。然而喉癌中lncRNA的作用机制以及lncRNA是否可作为生物标志物尚不清楚。该工作首先从TCGA数据库中下载喉癌的基因表达数据和患者临床特征，利用WGCNA分析得到9个共表达模块。发现pink模块与临床特征显著相关。基于pink模块中的73基因，构建了lncRNA-miRNA-mRNA和lncRNA-RBP-mRNA网络。生存分析发现了8个lncRNA显着影响喉癌患者的总生存期。且这些生存相关的lncRNA和模块中的hub基因的表达也通过qPCR在多个喉癌细胞系中得到验证。
结果
1. 喉癌的共表达网络的构建
利用R语言survival包识别与生存有关的临床特征，发现11个与生存相关的临床特征。再利用limma包对数据进行标准化，然后利用WGCNA对样本进行聚类，删除离群样本（图1A），进行加权共表达网络的构建，再绘制不同样本的临床特征的热图（图1B）。发现软阈值设置为5的时候R2为0.87（图2A），即符合生物学网络的无标度（scale-free）特性。因此采用beta=5进行加权网络的构建，不同的模块用颜色标记（图2B）。且绘制不同模块的基因之间的相关性（图2C）和模块之间的相关性（图2D）热图。
图1. A)TCGA数据集的样本聚类. B)样本临床特征热图
图2. 喉癌加权共表达网络的构建
2. 基因共表达模块与临床特征关联
对每个模块进行主成分分析（PCA），提取第一主成分认为是模块的特征基因（eigengenes），并计算临床特征与模块特征基因的相关性R和p值（图3）pink模块与四个临床特征显著相关。其中每个模块的基因数目见表1。并对pink模块的基因绘制genesignificance（GS）和module membership (MM)的散点图（图4A-D），发现MM高的基因一般有着高的重要性。进一步对pink模块中的基因进行后续分析。
图3. 模块与临床特征相关性热图
表1. 不同模块中基因数目
图4. Pink模块中gene significance和module membership的散点图
3. Pink模块的功能富集分析
通过提取pink模块中的73个基因和hub基因，利用GenCLiP进行功能富集发现10个统计学显著的信号通路（表2）。结果表明pink模块的基因富集到10个不同的cluster，说明喉癌可能和多个信号通路相关（图5）。
表2. pink模块基因显著富集的通路
图5. Pink模块基因富集分析
将pink模块的73个基因上传到STRING数据库，得到他们之间的蛋白质互作网络（图6A）。发现一些蛋白有着高的互作得分和共表达系数（例如RSAD2和OASL）。一些互作有高的互作得分却有着低的共表达系数（例如TRIM5和HLA-C），表明这些互作可能在信号级联中发挥一定的作用。同时通过cytoscape的ClueGO插件进行GO富集分析也发现和KEGG一致的富集结果（图6B）。
图6. Pink模块基因的PPI和GO富集分析
4. 网络分析和生存分析
通过starBase获取pink模块中的基因构成的ceRNA网络，发现三个lncRNA（CYTOR, HCP5和DANCR）与23个mRNA形成ceRNA网络（图7A）。lncRNA-RBP-mRNA网络分析发现13个lncRNA，19个RBP（RNA binding protein）和45个mRNA在网络中出现（图7B）。通过生存分析发现pink模块中26个lncRNA中的8个和生存显著相关（图8）
图7. lncRNA-miRNA-mRNA网络和lncRNA-RBP-mRNA网络
图8. Pink模块中与OS相关的lncRNA
5. RT-qPCR验证
利用qRT-PCR对生存相关的lncRNA（图9A）和WGCNA网络中的hub mRNA（图9B）进行验证，发现lncRNA和mRNA大部分均与正常细胞系差异表达。
图9. qRT-PCR验证生存相关的lncRNA和hub mRNA
总结
综上，该研究利用WGCNA发现pink模块与临床特征显着相关。且该模块的基因（lncRNA和mRNA）与喉癌的生存和发展相关。这些lncRNA和mRNA可以作为新的生物标志物进行喉癌的诊断和治疗。
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