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随着三代测序的普及，现在越来越多的序列拼接依赖三代测序长读长的特点，最开始的时候三代数据只作为二代测序的辅助材料，用来连接更长的scaffold与补洞，而现在，三代测序可以单独就行拼接，或者用二代测序来纠错，可以说，技术的发展，方法上已经发生了根本的变化。现在三代数据已经可以进行单独的拼接了，所以，赶快学习三代测序数据的拼接吧。
应用场景
1、手里有三代pacbio测序的数据，fastq格式或者fasta格式，需要连接成更长的基因组序列。
软件官网
https://github.com/PacificBiosciences/FALCON
falcon现在已经成为Pacbio的官方软件了。
官方文档页
https://pb-falcon.readthedocs.io/en/latest/tutorial.html
下载安装
话说这款软件安装使用比较变态，现在只支持pyhton2.7的版本，虽然提供了一个预编译的版本，但是还需要使用python的虚拟环境，也需要配置很多依赖软件，因此，依照通哥“珍爱生命，远离编译”的原则，还是使用bioconda来安装吧。不过即使是使用bioconda，依然需要首先创建个虚拟环境。话说软件名字叫做falcon，为什么又使用pb-assembly，主程序叫做 fc_run呢，实在是比较混乱，但是人家就这么人性，你也没办法，不喜欢就自己写一个。
1#利用bioconda创建一个虚拟环境，命名为pb-assembly
2condacreate-n pb-assembly
3#安装falcon
4condainstall-y pb-assembly
软件使用
如果你觉得软件安装比较乱，但其实那并不算什么，因为软件运行起来更乱。falcon运行起来主要分三大步骤。
第一步，将测序数据写入到一个文件中，可以是fastq，也可以是fasta，如果有多条，就分成多行来写，例如这里面，我们将文件命名为input.fofn
1$ cat input.fofn
2/ifs1/Sequencing/Pacbio/subreads.fasta
第二步，也就是falcon最核心的地方，将刚才的配置文件路径写入到配置文件中，跟在input_fofn选项后面，并设置软件的选项参数。
1$ head -20 fc_run.cfg
2#### Input
3[General]
4input_fofn=~/input.fofn
第三步，打开虚拟环境，运行软件，软件结束后，退出虚拟环境。
1$ cat falcon.sh
2#Pacbio拼接
3sourceactivate pb-assembly
4fc_run fc_run.cfg
5conda deactivate
配置文件
falcon软件选项参数并不在命令行写，而是都卸载配置文件中，因此，这个配置文件比较重要。也是这个软件最难的部分。根据注释信息，配置文件分为以下几大项：
input
Data partitioning
Repeat Masking
Pre-assembly
Pread overlapping
Final Assembly
其实绝大部分选项参数，根据英文简写基本上能看懂，详细信息可以查看软件帮助页面，有详细的介绍，绝大部分选项选择默认即可。
1#### Input
2[General]
3input_fofn=~/input.fofn
4input_type=raw
5pa_DBdust_option=
6pa_fasta_filter_option=pass
7target=assembly
8skip_checks=False
9LA4Falcon_preload=false
10
11#### Data Partitioning
12pa_DBsplit_option=-x500 -s50
13ovlp_DBsplit_option=-x500 -s50
14
15#### Repeat Masking
16pa_HPCTANmask_option=
17pa_REPmask_code=1,100;2,80;3,60
18
19####Pre-assembly
20genome_size=0
21seed_coverage=20
22length_cutoff=3000
23pa_HPCdaligner_option=-v -B128 -M24
24pa_daligner_option=-e.7-l1000 -k18 -h80 -w8 -s100
25falcon_sense_option=--output-multi --min-idt0.70--min-cov2--max-n-read800
26falcon_sense_greedy=False
27
28####Pread overlapping
29ovlp_daligner_option=-e.96-l2000 -k24 -h1024 -w6 -s100
30ovlp_HPCdaligner_option=-v -B128 -M24
31
32####Final Assembly
33overlap_filtering_setting=--max-diff100--max-cov300--min-cov2
34fc_ovlp_to_graph_option=
35length_cutoff_pr=2000
36
37[job.defaults]
38job_type=local
39pwatcher_type=blocking
40JOB_QUEUE=default
41MB=32768
42NPROC=2
43njobs=2
44submit= /bin/bash -c"${JOB_SCRIPT}">"${JOB_STDOUT}"2>"${JOB_STDERR}"
45
46[job.step.da]
47NPROC=1
48MB=32768
49njobs=2
50[job.step.la]
51NPROC=1
52MB=32768
53njobs=2
54[job.step.cns]
55NPROC=1
56MB=65536
57njobs=2
58[job.step.pla]
59NPROC=1
60MB=32768
61njobs=2
62[job.step.asm]
63NPROC=1
64MB=196608
65njobs=2
案例介绍
这里我们拼接一个细菌的基因组，基因组大小大概5.4M左右，采用pacbio测序。
1#激活falcon虚拟环境
2sourceactivate pb-assembly
3#运行软件
4fc_run fc_run.cfg
5#退出虚拟环境
6conda deactivate
结果解读
falcon默认会生成3个中间文件，都是固定命名，因此，当有多个样品的时候，最好每个样品单独创建一个文件夹。最终结果在2-asm-falcon文件中的p_ctg.fa，即是最终需要的文件。
10-rawreads/
21-preads_ovl/
32-asm-falcon/
统计结果
1$ fa 2-asm-falcon/p_ctg.fa
2Statistics: Scaffold Contig
3
4Total Number (#): 99 99
5Total length (bp): 5441422 5441422
6Gap(N)(bp): 0 0
7Average Length (bp): 54963.86 54963.86
8N50 Length (bp): 398330 398330
9N90 Length (bp): 21097 21097
10Maximum Length (bp): 623154 623154
11Minimum Length (bp): 3161 3161
12GC content : 44.05% 44.05%
---------- END ----------
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