每天一篇文献精读
作为一名博士生，文献的阅读贯穿整个科研过程，前期课题方向的选择，中期实验过程，后期的文章撰写和投稿都需要大量的文献阅读，因此，保持每天精读2~3篇高水平的文章，是发高水平成果必须每天都要坚持的习惯。通过公众号记录我的每天学习的进程，希望现在和以后能从中获益，提高自己的科研水平。
今天我精读的一篇文章名为“Ginseng Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy and Heart Failure via NHE-1 Inhibition and Attenuation of Calcineurin Activation” 2011年发表在Circ Heart Fail. 现在为1区期刊，影响因子6.526.
人参是我国传统名贵药材，使用历史悠久。人参皂苷是人参的主要活性成分，迄今为止（2011年），已经分离出了约40种人参皂苷，具有多种药理活性，有多个实验证明了，人参对心血管疾病的治疗作用：人参能够减轻阿霉素引起的心力衰竭；减轻左右心室肥大。作者通过动物实验研究慢性缺血继发的心力衰竭，细胞实验研究抗肥大作用；研究机制关注重点：胞膜离子交换蛋白Na-H交换泵-1亚型上（NHE-1）。
已有文献表明NHE-1会导致细胞内Ca离子超载，从而导致由 钙调磷酸酶 介导的Ca离子依赖性肥大的激活以及肥大转录因子的激活。
实验方法：
1、从1~4天大的大鼠心脏中制备心肌细胞，进行培养，用α1肾上腺素受体激动药——去氧肾上腺素（PE）处理细胞构建模型，用不同浓度的人参皂苷处理。
2、人参皂苷的提取 用75%的乙醇进行提取。
3、测量细胞表面积 用倒置显微镜拍摄进行测量。
4、细胞内Na和Ca2浓度的测量
5、细胞内PH的测定
6、钙调磷酸酶活性测定 使用试剂盒进行测量
7、NFAT3易位的测定 westernblot 进行测定
8、电泳迁移率分析（Electrophoretic-Mobility Shift Assay，EMSA)
9、超声心电图检测
10、血液动力学测量
11、westernblot检测GATA-4和NHE-1
实验结果：（实验结果用图或表显示更加直观，因此文章原文中有图或表时，尽量直接通过图或表进行解读。）
1、人参对PE诱导的心肌肥大的影响
图A和图B分别用细胞图和柱状图表示，用PE处理24小时，会显著增加心肌细胞的表面积（850±14 μm2到1090±20 μm2）。在PE＋10 μg/mL人参皂苷共处理的情况下，心肌细胞的表面积减少至942±44 μm2。图C表示，PE使ANP基因的表达增加了2倍（P<0.05），10 μg/mL人参皂苷几乎完全可以防止PE对ANP基因的上调。而单独使用人参皂苷对心肌细胞表面积和ANP基因表达均没有直接影响。
作者还将PE换成血管紧张素Ⅱ或内皮素-1处理心肌细胞，构建肥大模型，人参对这两种药物构建的肥大模型具有相似的作用。
2、人参对PE诱导的NHE-1基因表达、蛋白和活性变化的影响
图A显示，PE处理细胞24小时后，诱导NHE-1基因上调1.56±0.16倍；图B显示，NHE-1蛋白丰度提高1.38±0.09倍；图C显示，NHE-1活性显著上调。
在用人参不同浓度处理后PE心肌细胞模型，NHE-1的活性下降，特别是在10μg/mL人参皂苷处理情况下，使NHE-1基因表达的升高下调至1.18±0.04（图A），蛋白质水平的上升下调至1.07±0.10（图B），NHE-1活性的刺激降低到与对照相比没有明显差异（图C）。
3、人参对PE诱导的细胞内Na离子和Ca离子浓度变化的影响
给细胞施加PE后：15min就导致细胞内Na离子和Ca离子的浓度快速升高。
PE＋10μg/mL人参皂苷处理6h后，对Na离子和Ca离子的浓度没有明显变化，12-24h内，Na离子和Ca离子的浓度明显下降，24h后，Na离子和Ca离子的浓度与对照组没有显著差异
4、人参对PE诱导的钙调磷酸酶活性变化的影响
给细胞施加PE后，在15min内，钙调磷酸酶活性就迅速增加；
PE＋人参皂苷处理，6小时后钙调磷酸酶活性稳定下降，但仍显著大于对照；
单独施加人参皂苷，对钙调磷酸酶活性没有影响。
5、人参对PE诱导的NFAT3核输入和GATA-4激活变化的影响
图B显示，PE处理24h后，NFAT-3明显的转移到细胞核中；
对照组中的NFAT-3主要位于胞浆中；
人参皂苷组中，人参皂苷明显减少了PE诱导的NFAT-3的移位，与对照组NFAT-3的定位相似。
图C显示，PE显著提高了GATA-4的磷酸化1.3倍；
人参皂苷组显著降低了PE对GATA-4磷酸化的提高。
图D显示，PE显著提高了GATA-4与DNA的结合；
人参皂苷组阻止了这种反应。
6、人参对CAL引起的左心室功能障碍的影响
接下来，作者用动物模型验证人参对心肌细胞的保护作用，研究人参的抗肥大作用能否作用在动物上。
作者使用CAL持续四周处理大鼠，构建肥大模型。用人参进行治疗，结果显示CAL产生明显的收缩期和舒张期异常，通过人参皂苷的治疗后减弱。
图A和图B分别同超声图像和柱状图显示，人参皂苷治疗后，显著降低了CAL导致的大鼠左心室内径的增加。
图C和图D显示，人参治疗后，E/A比值转为正常，表明心脏的舒张功能得到了改善。
7、人参对CAL引起的心肌肥大的影响
图A显示，在结扎4周后，CAL处理的动物体重显著下降，不受人参皂苷的影响。
图D显示，接受CAL的动物表现出明显的左心室重量增加以及ANP表达上升；图B到图D显示左心室肥大的发展。通过人参处理后，这些均被阻止（消减）。
8、人参对CAL诱导的NHE-1表达及钙调磷酸酶活化的影响
图A显示，CAL处理的大鼠中的NHE-1表达显著增加（1.98±0.16倍），人参皂苷处理后NHE-1的表达有所下降（1.41±0.11倍）。
图B和图C显示，CAL处理的大鼠心脏中的MCIP-1和钙调磷酸酶的表达显著增加，而这些均被人参皂苷消除。
讨论：
尽管人参在亚洲已经被用作药物治疗，但其对心脏的特异性作用尚没有得到广泛的研究。人参也是美国最常用的替代药物之一，但关于人参能否用于治疗心血管疾病，仍缺乏临床数据和作用机理的研究。作者在这篇文章中确定了人参皂苷在抗肥大中的潜在作用。对于PE导致的心肌细胞的肥大，人参皂苷具有强大的抗肥大作用；人参皂苷还显著减弱了血管紧张素Ⅱ和内皮素1对心肌细胞的肥大作用。
人参皂苷抗肥大能力与防止NHE-1的激活/上调有关，而NHE-1与肥厚性和心力衰竭过程广泛相关。NHE-1的激活会导致许多细胞的改变，这些改变可能导致肥大性程序，NHE-1的激活导致的一个最重要的结果就是细胞内Na离子和Ca离子浓度升高。这反过来会通过激活肥大程序而诱导肥大，尤其是钙调磷酸酶，由于NFAT3的去磷酸化及其转位入核而导致转录变化。人参皂苷减弱血管紧张素Ⅱ和内皮素-1（2中NHE-1激活剂）的肥大作用的能力，进一步支持NHE-1作为其治疗作用的靶标。但是不能排除人参皂苷通过其他机制起治疗作用的可能性，需要进一步研究。
文章链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ginseng+Inhibits+Cardiomyocyte+Hypertrophy+and+Heart+Failure+via+NHE-1+Inhibition+and+Attenuation+of+Calcineurin+Activation
DOI:10.1161/CIRCHEARTFAILURE.110.957969
心得：
1、这篇文章作者通过多个角度验证，人参通过抑制NHE-1的上调，减轻细胞内Na离子和Ca离子浓度升高， 减轻NFAT-1的去磷酸化和转位入核。
先细胞实验研究人参对心肌细胞表面积、NHE-1、Na离子和Ca离子浓度、钙调磷酸酶活性、NFAT3核输入和GATA-4激活的作用。发现人参能够在细胞中减轻心肌细胞的肥大，其机制可能是抑制NHE-1依赖性钙调磷酸酶的激活。
然后进行动物实验，发现人参在动物中的抗肥大作用与细胞的抗肥大作用一致。
2、作者在实验设计中，设置空白组、人参组、PE组、人参＋PE组。
设置不同的人参皂苷浓度
设置不同的处理时间
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