基因表达值定量方法RPKM、FPKM和TPM标准化的概念和比较

转录组测序中，常见的几种reads count值的标准化方法，基于测序深度和基因长度进行标准化。

RPKM、FPKM和TPM标准化

RPKM（Reads Per Kilobase Million）计算方法：

    计算样本中的总reads数，然后将其除以1000000，获得百万缩放因子。

    将每个基因的reads count值，除以百万缩放因子标准化测序深度，获得每百万reads中来自该基因的reads比例（reads per million，RPM）。

    将RPM值除以基因长度（以千碱基为单位），获得RPKM。

FPKM（Fragments Per Kilobase Million）与RPKM非常相似：

    RPKM是针对单端测序而言，其中每个reads对应于一个已测序的片段；FPKM用于双端测序，两个reads（分为R1和R2端）对应一个测序片段（fragments）。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到成对的reads来源于一个DNA片段的测序，因此它不会来自同一fragments的reads进行两次计数。

TPM（Transcripts Per Kilobase Million）与RPKM和FPKM也比较相似，但计算顺序略有不同：

    将每个基因的reads count值除以每个基因的长度（以千碱基为单位），获得基因的每千碱基reads覆盖数（reads per million，RPK）。

    计算样本中所有RPK值，然后除以1000000，获得百万缩放因子。

    将RPK值除以百万缩放因子，获得TPM值。

因此可看到，TPM与RPKM和FPKM相比，唯一的区别是先对基因长度进行归一化，然后对序列深度进行归一化。但是这种差异的影响非常明显。

使用TPM时，每个样本中所有TPM的总和是相同的，这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的reads比例。使用RPKM和FPKM，每个样本中的标准化reads之和可能会有所不同，这使得直接在样本间比较更加复杂。

所以TPM方法正越来越流行。

如果样品1中基因A的TPM为3.33，而样品B中的TPM为3.33，则可以认为这两个样品中映射到基因A的总reads数的比例完全相同，因为两个样本中的TPM的总和始终为相同的数字（因此，无论要查看哪个样本，计算比例所需要的分母都是相同的。

使用RPKM或FPKM，每个样本中的标准化读数之和可能不同，此时如果样本1中基因A的RPKM为3.33，样本2中的RPKM为3.33，则难以获知两个样本中映射到基因A中reads的比例是否相同，这是因为计算比例所需的分母在两个样本之间可能是不同的。