RNA-Seq数据标准化方法

oriRNA

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在RNA-Seq的分析中，我们常用RPKM、FPKM和TPM作为转录组数据定量的表示方法。

它们都是对表达量进行标准化的方法，为何不直接用read数表示，而选标准化呢?

因为落在一个基因区域内的read数目取决于基因长度和测序深度。基因越长read数目越多，测序深度越高，则一个基因对应的read数目也相对越多。所以必须要标准化，而标准化的对象就是基因长度与测序深度。

RPKM:

Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads

(每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)，主要用来对单端测序（single-end RNA-seq）进行定量的方法。

RPKM(推荐软件，Range) 的计算公式：

；

total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；

mapped reads ( Millions ) :某个样本的所有reads总和；

exon length( KB )：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）。

你可以用这个公式计算基因，外显子，转录本的表达，这里以基因的表达为例进行说明。在一个样本中一个基因的RPKM等于落在这个基因上的总的read数(total exon reads)与这个样本的总read数(mapped reads (Millions))和基因长度(exon length( KB )) 的乘积的比值。

FPKM:

Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments

(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)，主要是针对pair-end测序表达量进行计算。

FPKM (推荐软件，cufflinks) 和RPKM 的计算方法基本一致。

FPKM和RPKM的区别就是一个是fragment，一个是read。

对于单末端测序数据，由于Cufflinks计算的时候是将一个read当做一个fragment来算的，故而FPKM等同于RPKM。

对于双末端测序而言，如果一对paired-read都比对上了，那么这一对paired-read称之为一个fragment，而如果一对paired-Read中只有一个比对上了，另外一个没有比对上，那么就将这个比对上的read称之为一个fragment.而计算RPKM时，如果一对paired-read都比对上了会当成两个read计算，而如果一对paired-read中只有一个比对上了，另外一个没有比对上，那么就计read数为1。 故而即使是理论上将各个参数都设置成一样的，也并不能说FPKM=2RPKM。对于单末端测序，虽然理论上FPKM等同于RPKM, 但是实际上即使是使用同一个mapping软件得到的mapping结果，然后再分别去计算同一个基因的RPKM (自己人工计算，或者用现成的一些软件都能算)和FPKM(用Cufflinks计算)，结果却仍然是不同，因为Cufflinks有自己的模型和自己的一些内在算法。

RPM/CPM:

Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads).

RPM的计算公式：

RPM=total exon reads / mapped reads (Millions)

total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；

mapped reads (Millions) :某个样本的所有reads总和；

RPM per gene is calculated as the number of reads per gene divided by the number of single-mapping reads per sample library times one million.

由定义和计算公式可直接看出RPM与RPKM的区别，这里就不做说明了。

TPM：

Transcripts Per Kilobase of exonmodel per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)，优化的RPKM计算方法，可以用于同一物种不同组织的比较。

TPM (推荐软件，RSEM) 的计算公式：

TPMi={( Ni/Li )*1000000 } / sum( Ni/Li+……..+ Nm/Lm )

Ni：mapping到基因i上的read数；

Li：基因i的外显子长度的总和。

在一个样本中一个基因的TPM：先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(Ni/Li)与校正后的这个样本的所有read数（sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)）求商。由此可知，TPM概括了基因的长度、表达量和基因数目。TPM可以用于同一物种不同组织间的比较，因为sum值总是唯一的。

(不喜欢看公式分析，那么看看这个实例吧：TPM值就是RPKM的百分比嘛！ | 生信菜鸟团)

总结：

不管是计算FPKM、RPKM，还是计算TPM，我们都要先得到一个ReadCount的矩阵（行为基因，列为样本）。在计算FPKM和RPKM时，都是先按列（也就是这个样本的总read数）进行标化，之后再对对个基因的长度进行标准化。而TPM是先对基因长度进行标准化，之后再对列（这个时候就不再是这个样本的总read数了）进行标化。这样使得最终的TPM矩阵的每列都相同（列和都等于1），也就是说每个样本中的TPM的和都是一样的。这样就会使得我们更容易去比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。而RPKM/FPKM由于最终的表达值矩阵的列和不同，故而不能直接比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。

参考：浅谈RPKM,FPKM,RPM,TPM的区别 - 生信技能树

RNA-seq数据预处理方法，哪个更适合你的问题

先说结论：

1.学术界已经不再推荐RPKM、FPKM；

2.比较基因的表达丰度，例如哪个基因在哪个组织里高表达，用TPM做均一化处理；

3.不同组间比较，找差异基因，先得到read counts，然后用DESeq2或edgeR，做均一化和差异基因筛选；如果对比某个基因的KO组和对照，推荐DESeq2。

4.如果找公司做RNA-seq数据处理，计算表达量时，记得要read counts。

在RNA-Seq的分析中，对基因或转录本的read counts数目进行标准化（normalization）是一个极其重要的步骤，因为落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。很容易理解，一个基因越长，测序深度越高，落在其内部的read counts数目就会相对越多。当我们进行基因差异表达的分析时，往往是在多个样本中比较不同基因的表达量，如果不进行数据标准化，比较结果是没有意义的。因此，我们需要标准化的两个关键因素就是基因长度和测序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)作为标准化数值。那么，这三者计算原理是什么，有何区别呢？

为了更清楚的展示计算过程，我们用三个样本的4个基因的read counts矩阵做例子（来源于YouTube）。如表1：

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大家可以清楚地看到，样本3的4个基因read counts数目明显多于其他两个样本，说明其测序深度较高，基因B的长度的基因A的两倍，也使得其read counts在三个样本中都高于A。接下来我们要做就是对这个矩阵进行标准化，分别计算RPKM, FPKM和TPM, 请睁大你的眼睛（为了使数值可读性更好，下面的计算中我们用10代表million）。

我们先来说说RPKM怎么算。第一步先将测序深度标准化，计算方法很简单，先分别计算出每个样本的总reads数（这里以10为单位），然后将表中数据分别除以总reads数即可，这样就得到了reads per million. 如下表2：

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第二步即是基因长度的标准化了。将表2的read per million直接除以基因长度即可，如表3：

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到这里，我们即得到了传说中的RPKM。

FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区别是FPKM适用于双端测序文库，而RPKM适用于单端测序文库。FPKM会将配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。

下面，终于轮到TPM登场了。虽然同样是标准化测序深度和基因长度，TPM的不同在于它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度，再是测序深度。我们仍以表1的那个例子来说明TPM是计算过程。

第一步直接除以基因长度，得到reads per kilobase，如表4：

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第二步标准化测序深度时，总的reads数要用第一步中除过基因长度的数值。即第一样本除以15，第二个样本除以20.25，第三个样本除以45.1 （别忘了我们的单位是10哦）。表5就是你们想要的TPM了。

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下面，是考验你们数学功底的时候了，有没有看出来TPM分分钟完虐FPKM/RPKM？其实，只要我们在表3和表5下面多加一行你就能很轻松地看到区别了。

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我们看到每个样本的TPM的总和是相同的，这就意味着TPM数值能体现出比对上某个基因的reads的比例，使得该数值可以直接进行样本间的比较。

看到这里，相信大家已经完全理解了RNA-Seq数据标准化的流程了。虽然现在有很多计算差异表达的软件是直接支持read counts作为输入，并且自已完成标准化过程，如DESeq2，知道这些中间量的计算过程还是很有必要的。

最后，奉上YouTube上的视频链接https://www.youtube.com/watch?v=TTUrtCY2k-w，可能需要FanQiang才能观看

不再用RPKM/FPKM，现在推荐用TPM

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一表看懂TPM更适合比较同一基因在不同sample间表达丰度的差异

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DESeq2或edgeR

DESeq2和edgeR不用RPKM/FPKM或TPM做均一化，而是直接用原始的read counts做均一化处理。

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DESeq2和edgeR能很好的解决这两个问题

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测序深度的差异问题，用RPKM/FPKM、TPM、DESeq2和edgeR都能处理

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如果组间RNA成分差异较大，怎么办？

例如liver跟spleen比，组织特异性表达基因在里面捣乱；再例如常见的某个基因KO组与对照相比，该基因成分在KO组里缺失。

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就用edgeR/DESeq2作均一化