单细胞，这绝对是近五年来组学领域最热的一个词，其特点便是对单个细胞的测序破除了多细胞体带来的平均化效应，使得一些微量信号也可以被挖掘出来。不得不承认，单细胞的出现确实是具有划时代意义的，将组学研究的视野提高到了一个新的维度；随之而来的，单细胞转录组、单细胞ATAC-seq、单细胞免疫组库、单细胞蛋白组等单细胞技术如雨后春笋般出现在人们的视野中，依稀单细胞多组学时代真正到来。
Each technology measures only particular aspects of cellular identity and has unique strengths and weaknesses——这是剑桥大学桑格研究所的Mirjana Efremova和Sarah A. Teichmann博士对于单组学的小结，同时也指出了多组学的发展必然性，描绘了单细胞多组学的蓝景——一个更加全面完善的分子机制解释体系[1]。但是，很多技术在单细胞方向上的延展并不是那么理想，基因组学的测序深度，表观组学的信噪比，蛋白组学的标记物，等等，都使得相关技术很难完成单细胞化，单细胞多组学的实现也就更难实现突破。
这时候我们不妨将多组学关联的目光放到常规组学（指以样本整体为单位进行建库测序的组学技术，例如普通转录组、蛋白质组、代谢组等）上来，单细胞组学的辉煌可并不意味着常规组学的没落；相反，单细胞组学与常规组学往往还能碰撞出不一样的火花——单细胞组学提供高分辨率的视野，常规组学提供更深的测序深度和多组学拓展。
今天，我们就先来一道开胃菜，一起来聊一聊单细胞转录组（scRNA-seq）和普通转录组（bulk RNA-seq）的关联策略。
1. 关联策略
说起来scRNA-seq和bulk RNA-seq，研究者常见到他们的地方是技术对比，都说scRNA-seq相较于bulk RNA-seq做出了多大的改进，而关联的还是少见甚至第一次听说。这两者的关联正是基于常说的“改进”的衍生。
诚然，scRNA-seq在分辨率上做出了很大的改进，但是也因此做出了牺牲，其基于polyA的RNA捕获策略和低浓度的扩增体系使得scRNA-seq在RNA覆盖和测序深度上都不如bulk RNA-seq。这也就造就了两个技术的主要适用症的差异。scRNA-seq的重点放在了对细胞类型的解析上，例如基因表达谱、细胞分化继承关系等，更注重从细胞类型的角度解释分子机制；bulk RNA-seq的重点放在了对基因的解析上，例如非编码RNA分析、可变剪切、基因调控网络等，更注重基因的变化对表型带来的影响。
表1 scRNA-seq与bulk RNA-seq技术对比
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scRNA-seq和bulk RNA-seq也因此形成了细胞与基因上面的互补。在实际关联中，我们可以采用两个实验设计思路：
（1）scRNA-seq补充bulk RNA-seq，bulk RNA-seq初步确定基因，scRNA-seq确定相关细胞类型，这个思路适合对于细胞的精细化研究。细胞大类是前人已经有所研究时，为了提高文章创新性，我们就需要向更精细的细胞类型进行研究。假设在普通转录组得到CD79A基因是一个关键基因，而这又是一个广泛认可的B细胞标记基因，此时说明样本的表型与B细胞相关，后续就可以选择，通过scRNA-seq对细胞亚类进行深入分析。
（2）利用普通转录组深入研究，scRNA-seq绘制图谱，bulk RNA-seq针对特定细胞类型研究，以细胞类型作为入手点，然后深入解析细胞的表达特征，这个思路适合对于细胞调控机制的深入解析，同时最好是应用于模式生物中。假设单细胞转录组的图谱对巨噬细胞的深入解析，确定了FOLR2+巨噬细胞亚型作为主要效应细胞，后续就可以通过流式分选技术获取FOLR2+巨噬细胞进行bulk RNA-seq，对其内部的基因调控机制进行深入分析。
2. 分析思路
前文所述两种关联策略，虽然解析方向有所不同，但是核心的分析内容上还是围绕两个点——细胞和基因。细胞的相对丰度变化引起样本的基因表达量变化，样本的基因丰度变化体现了相关细胞类型的数量波动，基因的变化特征和细胞的表达谱将两个组学的数据进行了关联。
对于两种关联策略，因分析目的的不同，在分析思路上也会有所差异。
（1）对应前文第一种关联策略，目的是将基因与细胞类型进行连锁。所以，我们可以选择一条相对并行的分析策略，bulk RNA-seq注重对基因的解读，scRNA-seq注重对细胞的解读，二者通过进一步基因来形成关联，这是充分利用了两个技术的优势特性。在这条分析思路中，基因承载着两个功能：机制解析和细胞注释。bulk RNA-seq可以通过多样的差异分析手段初步得到感兴趣的基因集合（这是标准的普通转录组分析思路，我们在此处不做过多展开，感兴趣的老师可以参见基迪奥公众号的其他微信文章~），与scRNA-seq得到的不同细胞类型的标记基因进行共有分析，进而得到一群既能解释表型又能关联细胞类型的基因。通过这些基因的标记基因功能去确定后续研究的细胞类型，进一步通过scRNA-seq的细胞图谱剖析选择的细胞亚群的表达谱特征，再与bulk RNA-seq的差异基因关联，一步步锁定最终的核心基因。
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图1 关联分析思路一
（2）对应前文第二种关联策略，目的是对目标细胞类型进行深入解析。所以，我们可以选择一条比较线性的分析思路，从细胞到基因逐渐深入。细胞图谱的解析成为scRNA-seq中比较重要的分析方向。一方面，细胞在不同样本的差异特征（包括细胞频率差异和基因差异）指示出主要的效应细胞群体；另一方面，效应细胞群体具有的特征基因是后续进行流式分选的重要依据（所以特征基因尽量选择膜蛋白基因）。后续，可以针对效应细胞群体，采用bulk RNA-seq进行深入分析。这个部分的分析思路相对比较传统，但是我们需要注意两点：一是生物学意义的变化，增加了细胞类型这一层含义（在一般的bulk RNA-seq使用较少），所以差异分析可以从细胞之间的差异和处理组之间的差异两方面入手，具体应用则根据实际情景有所侧重，多个效应细胞群体侧重细胞间差异，单个或两个效应细胞群体侧重处理组之间的差异；二是RNA覆盖度的扩展，引入非编码RNA甚至是可变剪切的特征描述，这是bulk RNA-seq相对于scRNA-seq的一个重要优势，同时非编码RNA也是调控基因表达的一个重要因素，更完善的基因调控网络的构建更有助于提高文章的创新性。
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图2 关联分析思路二
小结
单细胞组学确实给组学研究带来了更高的分辨率，基于细胞层面的研究也使得过去因为细胞异质性而引起的表型特征得到了解释，但是单一组学的弊端也在单细胞组学中得到了明显的体现——上下游调控机制的缺乏，多组学成为一个主要的述求。今天我们重点讨论了scRNA-seq和bulk RNA-seq之间的关联策略，可以看到即使是同为转录组研究，两个技术之间的关联也带来了不一样的数据解释角度。更多的应用案例我们就不一一解读了，放在参考文献中，感兴趣的可以自提。后续我们也将讨论更多的组学关联方案，敬请期待~~
参考文献
[1] Efremova M, Teichmann SA. Computational methods for single-cell omics across modalities. Nat Methods. 2020 Jan;17(1):14-17. doi: 10.1038/s41592-019-0692-4.
[2] Nalio Ramos R, Missolo-Koussou Y, Gerber-Ferder Y & et al. Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+ T cell infiltration in human breast cancer. Cell. 2022 Mar 31;185(7):1189-1207.e25. doi: 10.1016/j.cell.2022.02.021.
[3] Biram A, Liu J, Hezroni H & et al. Bacterial infection disrupts established germinal center reactions through monocyte recruitment and impaired metabolic adaptation. Immunity. 2022 Mar 8;55(3):442-458.e8. doi: 10.1016/j.immuni.2022.01.013.
[4] Mo YQ, Nakamura H, Tanaka T & et al. Lysosomal exocytosis of HSP70 stimulates monocytic BMP6 expression in Sjögren's syndrome. J Clin Invest. 2022 Mar 15;132(6):e152780. doi: 10.1172/JCI152780.
[5] Gu W, Wang H, Huang X & et al. SATB2 preserves colon stem cell identity and mediates ileum-colon conversion via enhancer remodeling. Cell Stem Cell. 2022 Jan 6;29(1):101-115.e10. doi: 10.1016/j.stem.2021.09.004.
[6] Affo S, Nair A, Brundu F & et al. Promotion of cholangiocarcinoma growth by diverse cancer-associated fibroblast subpopulations. Cancer Cell. 2021 Jun 14;39(6):866-882.e11. doi: 10.1016/j.ccell.2021.03.012.
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