大家好呀！今天给大家介绍一篇2021年4月发表在Nature reviews cancer上的一篇综述，讲述的是一个前沿且具挑战的话题。突变学说是癌症发生的经典模型，细胞通过获得驱动突变具有生长优势，被选择后引起克隆的异常扩张，导致癌症的发生。然而最近的研究表明被选择的克隆进化并不总是意味着癌症发生，人们在正常的组织和器官中发现了含有癌症驱动基因突变的克隆扩增，这可能与衰老、组织对环境刺激的应答和慢性炎症有关。这类研究在近两年来爆发，且都是发表在CNS上。理解正常组织的突变为了解早期致癌过程提供了机会，所以在这篇综述中，作者概述了非癌症组织中克隆扩增的发现，并对其生物学意义进行讨论。
Clonal expansion in non-cancer tissues
非癌组织中的克隆扩张
首先我们来了解一下克隆的概念
由一个祖先细胞产生的细胞群称为克隆。因为我们体内的细胞从它们的祖先那里遗传了体细胞突变，我们的身体最终是由克隆的递归层次构建的，这些克隆共享一套独特的突变集合（图1）。在发育过程中，获得体细胞突变的克隆可能会扩张，这一现象被称为体细胞镶嵌现象（somatic mosaicism）。在发育之后，一个体细胞突变的细胞只有很小的机会促成大规模镶嵌，除非它获得驱动突变，使细胞被正向选择。驱动突变的概念是讨论成年期非癌症组织克隆进化的核心。这种带有驱动突变的克隆可以在严重组织破坏过程（如慢性炎症）中迅速扩张，整个过程被形象的描述为瓶颈效应。
图1. 克隆以及瓶颈效应
体细胞突变是如何发生的呢？
人类基因在复制的过程中保持着惊人的准确性，即便是这样，突变仍会以较低的频率发生在正常的细胞中。有研究表明正常组织会以恒定的突变率来累积突变（每年出现13~44个突变）。研究人员通过分解癌症基因组中体细胞突变能够分析出这些突变的来源，即突变过程。突变签名（mutational signature）用来刻画不同的突变过程所造成的独特的突变模式。迄今为止，人们已经在癌症基因组中描述了80多个突变签名，如与年龄相关的甲基胞嘧啶自发脱胺，APOBEC致突变过程，紫外线暴露，烟草暴露和酒精暴露等。其中一些签名在正常的组织中也被发现（图2），对应的突变过程就可能与癌症早期的克隆扩张相关。
图2. 正常组织的突变率和相关病因
正常组织的克隆进化
与年龄相关的克隆性造血
克隆性造血（clonal haematopoiesis）是造血干细胞分化成为各系成熟细胞的过程，这些成熟血细胞会发生遗传学的异常。克隆性造血具有分化成为成熟血细胞的能力，但无恶性克隆扩增的特点。大规模的研究评估了克隆性造血带来的突变情况，其最常与DNMT3A突变相关，其次是TET2、ASXL1、JAK2，这些突变均是髓系恶性肿瘤中最常见的突变基因。同时该现象与年龄相关，突变很少在40岁以下的个体中观察到，随着年龄增长，突变频率也越来越高，70岁以上的个体中10%以上均发生了突变。克隆性造血的突变主要是CpG二联核苷的C>T的突变，暗示着甲基化胞嘧啶的自发脱氨是突变的主要来源。克隆性造血过程也会带来拷贝数的异常，与突变的情况一样，随着年龄的增长，个体中检测到的拷贝数异常频率也在增加，并且与血液癌中突变基因所在的染色体区域存在显著重叠。值得注意的是，与无克隆性造血的患者相比，具有克隆性造血相关拷贝数变异的患者发生血液系统恶性肿瘤的风险增加了35倍，具有克隆性造血相关突变的患者发生髓系肿瘤的风险大约增加了10倍，这提示克隆性造血可能是血液系统恶性肿瘤的起源。
实质器官中受正选择的克隆扩张
随着克隆性造血的报道，人们开始将研究转向了其他非癌症组织的克隆进化，包括皮肤，食道，大肠，肝脏，支气管，子宫内膜和尿路上皮。这些实体组织中的克隆扩增在一些方面不同于克隆性造血。克隆性造血过程的克隆可以通过血流扩散到整个体内循环，并与许多潜在的竞争者竞争克隆优势。与之相比，实质组织中克隆的扩张在空间上局限于一个小区域，它们附着在周围的细胞、基底膜和结缔组织上，这通常小于几平方毫米，因此克隆竞争受到限制。除驱动基因突变在克隆扩张中起着关键作用外，组织解剖学特点也限制了克隆扩张。如在结直肠上皮细胞中，干细胞的突变局限于隐窝（crypt），它只能通过复制整个隐窝来补充并扩展到隐窝之外（图3）。相比之下，在其他器官的上皮细胞中，如皮肤、食道、支气管和膀胱，位于基膜上的干细胞可以通过与周围干细胞的竞争而传播到邻近区域。在子宫内膜中，上皮腺体的细胞在月经周期中反复增殖和腐败，这为带有体细胞突变细胞的腺体在子宫内膜中繁殖提供了机会。在受慢性炎症影响的组织中也发现了类似的结构破坏周期，如炎症性肠病、慢性肝炎和再生障碍性贫血，促进突变细胞的克隆扩增。在这些炎症组织中，组织破坏后的瓶颈也有助于积极选择的克隆的扩展，从而战胜周围的正常细胞。
图3. 在结肠的正常组织中克隆扩张
鳞状上皮中的克隆扩张
在一项对皮肤的基因组的评估中发现，暴露在阳光下的眼睑上皮细胞受到了广泛的克隆正向选择（dN/dS>1），发生了NOTCH1、FAT1和TP53等突变，这些基因在皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中经常发生突变。平均来说，基于变异等位频率估计的驱动突变克隆的大小较小，大多数小于采样面积的10%。克隆的大小取决于突变驱动基因的类型，FGFR3突变的克隆往往比TP53突变和NOTCH1突变的克隆更大。而从整体来看，NOTCH1突变的细胞最普遍，其次是NOTCH2以及 TP53突变的细胞。正如预期的那样，这些突变符合紫外线暴露相关的突变模式。在另一项研究中观察到非日晒皮肤的克隆扩张比日晒皮肤的克隆扩张要小，尽管两者都以年龄依赖的方式进行克隆扩张，这表明环境因素可以加速克隆扩张。
同样一些研究发现了正常的食管上皮中普遍存在驱动突变克隆，且随着年龄的增长，阳性选择的克隆数量不断增加，食管上皮逐渐重塑。驱动突变克隆在20多岁的个体中只占食管上皮的不到10%，但在60多岁及以上的个体中，它们可以重塑多达80%的食管上皮。此外突变的数量和变异等位基因频率显著地受到大量吸烟和饮酒的影响，吸烟和饮酒使得驱动基因突变频率较高，驱动突变克隆较大。同样的，在正常上皮中发现的突变与食管鳞状细胞癌和其他鳞状细胞癌中发现的驱动基因显著重叠，最常涉及的是NOTCH1，其次是TP53、FAT1、NOTCH3和NOTCH2。
图4. 在正常鳞状上皮中的克隆扩张
吸烟对支气管上皮的影响
正常的支气管上皮中同样发现了正向选择作用，尤其是吸烟的人群。突变负荷的程度与年龄和吸烟状况有关，在儿童样本中没有发现驱动基因的突变，且在不吸烟的成年人中具有驱动突变的细胞数目很少，而吸烟者的样本中驱动突变的细胞数目较多，突变负荷较高。在已知的肺癌驱动基因中，包括NOTCH1、TP53和ARID2等在内的基因显示出正向选择的证据。因此，与食管上皮相似，支气管上皮经历与年龄与环境相关的重塑，正向选择的细胞具有在肺癌中常见的驱动突变。有趣的是，研究还发现有一小部分吸烟者和已戒烟者的突变负荷与不吸烟者的突变负担相当，而且已戒烟者比当前吸烟者的突变负荷小。这些观察结果表明，可能有一小部分独特的支气管细胞存在，它们即使在暴露于烟草后也不太可能积累突变，与其他可积累突变的细胞相比，它们可以更快地增殖，并在戒烟后部分恢复支气管上皮。即正向选择的细胞扩张是可逆的，并且在损伤消失后可以恢复，这与一项观察结果是一致的，吸烟者在中年或更早戒烟后可以降低罹患肺癌的风险。
子宫内膜上皮细胞中的克隆扩张
子宫内膜上皮所经历的与年龄相关的克隆扩张更为突出。最近的一项研究表明，在50岁时，几乎所有的子宫内膜腺体都被一个或多个驱动突变克隆所取代，其中驱动突变的数量随年龄线性增加，且与分娩次数呈负相关。
图5. 在正常子宫内膜上皮中的克隆扩增
尿路上皮中的克隆扩张
同样在大多数正常尿路上皮样本发生了体细胞突变，且随着年龄的增长突变负荷增加。考虑到大多数克隆扩张区域小于微活检的大小,这表明尿路上皮被重塑为拼接起来的小克隆扩张区域。在中老年人中，保守估计8~19%的细胞携带驱动突变。正常的尿路上皮正向选择的基因与膀胱癌常见突变的驱动基因重叠。在这些基因中，染色质重塑基因KMT2D、KDM6A、ARID1A、EP300和STAG2的突变最为常见。APOBEC致突变过程在不同克隆之间造成的突变负荷不同，表明APOBEC诱导的突变存在局部效应。两种特征明显的突变过程（SBS22和SBS16）在中国人的样本中经常出现，它们分别与亚洲传统草药中的马兜铃酸的暴露以及酒精暴露有关。
其他器官的克隆扩张
对黑素细胞的研究表明长期受阳光照射部位的黑素细胞比阳光遮蔽部位的黑素细胞携带更多的突变，但间歇性受阳光照射部位的黑素细胞，如背部和四肢的黑素细胞，比来自长期阳光照射部位的黑素细胞显示出更多的突变。这些发现与间歇性暴露在阳光下的皮肤比长期暴露在阳光下的皮肤患黑色素瘤的概率更高是一致的。黑素细胞中最常受影响的基因是MAPK通路的基因，如NF1、CBL和RASA2的功能缺失突变和BRAF （V600E除外）、NRAS和MAP2K1的功能获得突变，而低累积太阳损伤的黑色素瘤和前体病变痣主要是由BRAF V600E驱动的，这反映了两种不同的黑色素瘤发展轨迹。
炎症反应和克隆扩增
正常和炎症的结直肠上皮细胞中的克隆扩张
结直肠上皮是由单层柱状细胞构成，这些细胞被压缩成许多被称为隐窝的小复制单位。
每个隐窝由约2000个细胞构成，这些细胞由隐窝底部的干细胞来补充。在从新生儿到成年的正常发育过程中，结直肠上皮的隐窝数量通过隐窝分裂增加8到10倍，达到约1000万个隐窝，并在整个成年期保持不变。隐窝的系统发育分析显示隐窝数量在20岁前呈稳定增长趋势，年分裂率约为0.136，而在稳定状态下，隐窝很少发生分裂（0.004次每年），以平衡隐窝的生理缺陷。在10年的时间里，平均只有4%的隐窝消失并被分裂的隐窝所取代。与正常的皮肤、食管、子宫内膜和支气管上皮形成鲜明对比的是，在正常的结直肠上皮中很少观察到克隆扩张。大规模的隐窝全基因组测序显示，只有1%的隐窝存在已知或潜在的癌症驱动基因突变，且大多局限于单个隐窝。除少数的 AXIN2突变外，未观察到经常在结直肠癌中经常发生的肿瘤抑制基因APC或WNT通路基因的突变。
然而在包括溃疡性结肠炎和克罗恩病在内的炎性的结直肠上皮中，正向选择克隆的突变景观与正常上皮有很大的不同。在长期溃疡性结肠炎患者中，大量受正向选择的隐窝扩张，结直肠上皮被广泛重塑，可能是由于慢性炎症引起的细胞周期中DNA修复功能的损伤。溃疡性结肠炎衍生的隐窝系统发育树的模式支持了这一假设，该树与健康个体的隐窝不同，其特征是树干非常长，最近扩展了许多分支。溃疡性结肠炎患者的结肠上皮细胞的突变率是正常隐窝的三倍。突变以年龄相关的C>T转变为主，与SBS1突变信号对应，反映了细胞更替和细胞周期的增强，此外还发现了可能与炎症过程有关的突变过程。共有14个基因被正向选择，包括NFKBIZ, ARID1A, PIGR, KRAS, ZC3H12A和TRAF3IP2。这些基因与结直肠癌中检测到的驱动基因重叠，但它们的突变频率在溃疡性结肠炎患者和结直肠癌样本之间存在显著差异。特别是结直肠癌中APC、WNT通路基因、SMAD4、TP53等基因突变在溃疡性结肠炎患者隐窝中突变频率较低，而编码IL-17等炎症相关受体信号分子的基因突变高度富集。溃疡性结肠炎患者手术切除的直肠上皮中，平均有70%被正向选择的隐窝重塑。据估计多达54%的上皮细胞来自IL-17和其他炎症信号通路基因突变的隐窝。
正常肝和炎症肝中的克隆扩张
与正常肝脏样本相比，肝硬化样本具有更高的突变负荷，尽管数量仍然远低于肝癌样本。但肝硬化的肝脏样本中发生了较明显的染色体碎裂（chromothripsis）现象。同时一些肝硬化肝脏样本显示克隆扩增，但这些克隆也仅限于存在于一个由纤维束分隔的再生结节内，相邻结节之间没有共享的突变。与溃疡性结肠炎患者的结肠上皮不同，这些克隆中只有小部分携带驱动突变。此外，相邻结节中克隆受突变过程的影响表现出异质性。如烟草暴露、马铃酸暴露和黄曲霉毒素均显示出区域差异，这种诱变因子局部效应的机制及其在肿瘤发展中的意义尚不清楚。
图6. 炎性肝脏中的克隆扩张
下面这张图为我们整理了上述的所有结果
图7. 正常组织中的克隆扩张总结
看了那么多，那正常组织中的克隆扩张意味着什么呢？
这些针对于正常组织突变的研究让我们知道在非癌症组织中正向选择的克隆扩张是相当普遍的。与正常组织中遗传物质不变的传统假设相反，我们的身体在一生中可能不会在遗传上保持稳定。由于衰老、慢性炎症和许多环境损害的存在，某些组织中的组织经常不可避免地被正向选择的克隆进行广泛的重塑，以至于几乎整个组织都被新的克隆所取代。这些发现不仅为癌症发病机制提供了重要的见解，而且阐明了通过达尔文选择将突变体引入生态系统中来实现稳态调节。
正常组织中受正向选择的克隆可能作为癌症的起源
至于癌症的起源，在不同正常组织和相应的癌症样本之间的驱动突变的显著重叠指出了一个共同的机制：克隆的正向选择在癌症发生过程中起重要作用，癌症可能起源于那些一个或多个具有癌症驱动突变且表型正常的克隆。并且在许多组织中，正向选择的克隆的数量和大小随着年龄的增长而增加，并与已知的癌症风险相关，包括吸烟，饮酒，低分娩次数，紫外线暴露，慢性炎症和马兜铃酸暴露等。此外，在许多损伤的，易感癌症的组织中观察到驱动突变克隆负荷的增加，如肠炎和萎缩性胃炎的上皮细胞、肝硬化的肝脏、再生障碍性贫血的骨髓和大量烟草和酒精暴露的食管上皮细胞等。
图8.正常组织中正向选择的克隆作为癌症的起源
正常组织中受正选择的突变的不同影响
然而，正常组织中驱动突变的存在与癌症发展之间的联系需要进一步评估。虽然在正常组织中正向克隆选择的显现很常见，但仅在小部分个体中这些克隆会演化为癌症。例如，尽管食管上皮几乎完全被带有驱动突变的克隆重塑，但罹患食管癌的风险估计仅在1/41到1/228之间。此外，每年只有1%的克隆性造血患者发生髓系肿瘤。同样，尽管到更年期时子宫内膜几乎被突变克隆完全取代，但患子宫内膜癌的风险仍仅为1/31。因此，一个关键的问题是，进化成癌症的克隆与绝大多数没有进化成癌症的克隆之间的区别是什么。
然而，在正常组织中关于正向选择克隆的生物学影响的研究仍然有限。最近关于克隆性造血的研究报告称，克隆性造血的白血病风险在不同个体之间并不一致，这取决于与克隆性造血相关的驱动突变的数量和类型以及带有驱动突变的克隆的大小。在一个克隆性造血的大队列研究中，TP53和U2AF1突变比其他突变具有更高的髓系肿瘤发展风险。同样，在再生障碍性贫血患者中，与PIGA和BCOR突变的患者相比，携带DNMT3A、ASXL1和其他突变的患者发生血液恶性肿瘤的风险更高。处于食管癌风险生活方式的个体中（如吸烟，酗酒），驱动突变和拷贝数变异的负荷较高，而在癌前样本中，这种负荷甚至更高。
正常组织和癌症组织之间正向选择突变频率的差异也表明驱动突变对癌症发展具有非均一性的特点，尽管它们在两个组织中有显著的重叠。有些突变在癌症中比在相应的正常组织中更常见，这表明在癌症发展中获得这些突变的重要性。TP53突变就是一个典型的例子，它是人类癌症中最常见的突变基因。然而，在正常组织的克隆中，TP53突变的频率要低得多。广泛的拷贝数变异或等位基因失衡经常与双等位TP53突变相关，也是癌症的重要标志，但在正常组织中，拷贝数变异或等位基因失衡比癌症组织的广泛程度要小得多。在子宫内膜、尿路上皮、支气管和食管上皮以及溃疡性结肠炎患者的结肠上皮中，也观察到正常组织和癌症组织之间驱动基因突变的独特模式。CTNNB1、ARID1A和 TP53在子宫内膜癌中突变的比例高于正常子宫内膜细胞。特别是，在子宫内膜上皮中很少发现PTEN突变，但在多达85%的子宫内膜样癌中发现。TP53、FGFR3和TERT启动子突变在尿路上皮癌中非常常见，但在正常尿路上皮中很少发现。在食管组织中, TP53、NFE2L2、CDKN2A和FBXW7基因在癌症样本中比正常食管上皮具有更高的突变频率，这表明这些基因的突变在致癌方面可能比其它基因更重要。
图9. 正常组织和癌症组织中驱动基因突变频率的差异
相比之下，正常组织中的其他驱动突变对癌症发展的贡献似乎较少。据统计60%的正常食管上皮样本中发现NOTCH1突变，而只有不到20%的食管癌样本中发现NOTCH1突变。此外，包括FAT1、NOTCH2/3、ZFP36L2和PPM1D在内的基因在正常食管样本中的突变频率比癌症样本中要高。癌组织中较低的突变频率可能表明这些突变在正常组织中被正向选择，但在重塑食管组织的癌变过程中可能发生负选择。同样，NFKBIZ和ZC3H12A突变在溃疡性结肠炎上皮细胞中被强烈正向选择，但在结肠炎相关的结直肠癌样本中的突变频率较低。在非炎症环境下，通过对5个结直肠细胞系的CRISPR筛选发现NFKBIZ敲除的癌细胞从培养中被负选择。NFKBIZ突变的负作用也得到了结肠炎相关癌变的体内模型的支持，在该模型中，结直肠肿瘤在NFKBIZ敲除小鼠中被显著抑制。PPM1D在原发性髓系肿瘤中很少突变，而通过无偏性分析确定其为克隆性造血的驱动因素。PPM1D突变在正常食管上皮中也很常见，特别是在重度吸烟者和饮酒者中，但在食管鳞癌样本中极为罕见。人们认为，在羧基端富集的PPM1D突变可导致功能获得，并激活磷酸酶，通过p38激活来阻止磷酸化介导的p53激活。因此，突变的PPM1D使细胞对与化疗和其他环境损伤相关的DNA损伤具有抗性，这可能是PPM1D突变在接受高剂量化疗后的克隆性造血患者中相对常见的原因。
突变在癌变过程中的不同作用可能决定正向选择克隆的命运。例如，由于存在失活的NFKBIZ突变，覆盖溃疡性结肠炎上皮33%以上的克隆被正向选择，但实际上从未导致癌症。这些观察表明，要正确评估癌症中驱动突变的重要性，需要考虑正常或癌前组织背景中的突变，而不仅仅是癌症中的突变。
正向选择在非肿瘤病理生理中的意义
正向选择的克隆被证明能改变正常组织的功能或改变疾病进程，从而竞争过非突变细胞。因此，考虑正向选择克隆对组织重塑的功能影响是很重要的。这方面一个重要的发现是，克隆性造血比高血压带来更高的心血管疾病风险。实验表明TET2缺陷的造血干细胞移植小鼠通过诱导巨噬细胞产生炎性细胞因子从而增加动脉粥样硬化风险。携带NOTCH1突变的克隆对食道上皮和暴露在阳光下的皮肤进行了与年龄相关的逐步重塑，表明这与衰老有关。如上所述，慢性炎症经常通过反复的组织破坏和修复循环来选择驱动突变的克隆，最终导致组织重塑，这可能有助于在刺激炎症和组织破坏之间建立新的平衡。如Arid1a、Pkd1或Kmt2d缺陷的小鼠对化学性肝损伤具有保护作用，这些基因是肝硬化样本中最常见的突变基因。溃疡性结肠炎上皮细胞通过炎症信号基因突变的克隆重塑来改变早期溃疡性结肠炎的临床图像，这些克隆可能对IL-17诱导的凋亡具有抗性。如在溃疡性结肠炎上皮细胞中Traf3ip2缺失的基因工程小鼠显示结肠炎缓解，而另一项研究则显示结肠炎加重。另一个在溃疡性结肠炎上皮中突变的基因PIGR参与胃肠道中IgA的胞吞作用，PIGR基因敲除导致生态失调，诱导结肠炎恶化。在皮肤、食道、子宫和尿道中，随着年龄的增长，大量上皮细胞被正向选择的克隆重塑，而不存在慢性炎症。这一过程可能不仅涉及癌症的发展，而且涉及与衰老疾病相关的组织功能受损，这些都是未来研究中需要重点探索的内容。
结论与展望
我们的身体持续的被正向选择的克隆重塑，这符合特定生态系统下适者生存的原则，为癌症的进化奠定了基础，也与衰老等非肿瘤疾病的发展有关。重塑的程度在很大程度上取决于组织类型和选择所处的生态系统，如慢性炎症、酒精和烟草暴露等。尽管它们与癌症发展有着明确的关系，但正向选择克隆的普遍特性提出了一些关键问题.
为什么只有少数或没有克隆最终进化成癌症？
是什么机制阻止了大量被正向选择的克隆发展成癌症？
如何以及何时有必要逃避免疫反应？
微环境在这其中起到了什么作用？
我们应该回答这些问题，理解正向选择对癌症发展中的作用，并探索突变对正常组织的影响。鉴于目前大多数关于正常组织中正向选择的发现依赖于基因分析，包括驱动基因的突变的频率、突变特征以及克隆结构和进化，而缺乏功能研究，这对澄清这些突变和正向选择的生物学意义是非常重要的。正选择克隆对正常组织的重构相关研究才刚刚开始，对正选择的研究能更好地了解我们的身体如何通过突变克隆的选择来适应不同的生态系统，并为癌症的早期诊断甚至预防提供新的线索。
参考文献
以下列出了本综述相关的一些非癌组织的克隆扩张研究，这类研究近两年来爆发，且全是发表在顶刊上的，感兴趣的小伙伴可以去看看，有钱的老板可以去研究一下，也可申请数据用到自己的研究中来增彩。
1Somatic mutant clones colonize the human esophagus with age. Science. 2018
2Age-related remodelling of oesophageal epithelia by mutated cancer drivers. Nature. 2019
3The genomic landscapes of individual melanocytes from human skin. Nature. 2020
4Tobacco smoking and somatic mutations in human bronchial epithelium. Nature. 2020
5Frequent mutations that converge on the NFKBIZ pathway in ulcerative colitis. Nature. 2020
6The landscape of somatic mutation in normal colorectal epithelial cells. Nature. 2019
7The mutational landscape of normal human endometrial epithelium. Nature. 2020
8Extensive heterogeneity in somatic mutation and selection in the human bladder. Science. 2020
9Macroscopic somatic clonal expansion in morphologically normal human urothelium. Science. 2020
10Embryonal precursors of Wilms tumor. Science. 2019
11Somatic mutations and clonal dynamics in healthy and cirrhotic human liver. Nature. 2019
12Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium. Nature. 2020
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