Expression of Immune Related Genes and Possible Regulatory Mechanisms in Alzheimer's Disease
阿尔茨海默病中免疫相关基因的表达和可能的调节机制
发表期刊：Front Immunol
发表日期：2021 Nov 5
影响因子：7.561
DOI: 10.3389/fimmu.2021.768966
一、背景
阿尔茨海默病（AD）是最常见的进行性痴呆，以记忆衰退和严重残疾为特征。从病理学上讲，AD大脑中存在着由细胞内过度磷酸化和错误折叠的tau和细胞外淀粉样β（Aβ）形成的神经纤维缠结（NFTs）。近年来，神经炎症和组织内的免疫细胞越来越被认为是AD发病机制的关键因素。
脑常驻小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中局部免疫系统的主要成分，外周免疫细胞在健康大脑中不存在或很少见。此外，血脑屏障（BBB）为中枢神经系统免疫系统建立了免疫特权。在AD小鼠模型和人类AD大脑中都观察到外周免疫细胞的浸润。免疫相关基因（IRG）在免疫浸润中起着至关重要的作用；然而，IRG的表达特征和AD中免疫浸润的可能调节机制仍不清楚。
二、材料与方法
1、数据来源
1）单细胞数据集：GSE181279、GSE142853 scRNA测序数据集
2）微阵列数据：GSE33000
2、分析流程
1）scRNA测序数据处理：使用Seurat R软件包进行下游的主成分分析（PCA）和t分布式随机邻接嵌入（t-SNE）分析
2）IRGs评分：根据ImmPort数据库对每个簇的DEGs进行筛选以确定IRGs，并选择DEGs中的212个IRGs用AUCell进行IRGs评分
3）批量测序数据处理：使用limma软件包计算DEGs
4）GO和KEGG分析：使用Enrichr(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)对
GSE181279中NK群的DEGs和GSE33000中的DEGs进行富集分析
5）构建PPI网络：STRING
三、实验结果
01 - AD中PBMCs的scRNA分析
对GEO数据库中的scRNA测序数据集（GSE181279）进行了分析，其中包括36,849个PBMCs，包括22,775个AD患者的细胞和14,074个对照（NC）的细胞。经过过滤，保留了24,679个细胞，包括14,033个AD患者的细胞和10,646个NC的细胞。每个样本的表达特征见图1A。代表唯一分子标识符（UMI）数量的nCount_RNA与代表基因数量的nFeature_RNA呈正相关，相关系数为0.92（图1B）。前10个高度可变基因（HVG）被确认（图1C），S100A8和S100A9是前两个HVG，它们是小型钙结合蛋白，在炎症条件下高度表达。PCA确定了所有15个P值<0.05的PC，用JackStrawPlot可视化（图1D），用10个PC确定了8个簇，每个簇的前10个DEG被列出（图1E）。
图1 AD中PBMCs的scRNA分析
使用t-SNE分析对这八个聚类进行了可视化（图2A）。椭圆标记的NK簇显示AD组中NK簇的比例下降（图2B）。细胞类型标记基因的表达显示在点图（图2C）和Violin图（图2D）。图2E显示了每个簇的细胞数量和比例，与NC组相比AD组的NK簇明显减少，而CD4 T细胞在AD组呈上升趋势（图2F）。
图2 每个亚群的标记基因表达
02 - AD中PBMC细胞群的IRG评分
为了研究AD中PBMCs的IRG表达特点，作者根据ImmPort数据库筛选IRG，该数据库汇总了已发表研究的IRG，从PBMCs中每个簇的DEGs中得到212个IRG。AUCell R软件包被用来确定每个细胞系的IRG活性（图3A）。表达更多基因的细胞表现出更高的AUC值，这些细胞主要在NK和DC细胞中，颜色为黄色（图3B）。由于NK簇在AD组明显减少（图2B，F），进一步对PBMCs的NK簇中的DEGs进行GO和KEGG分析,这些术语主要与抗原处理和免疫反应有关（图3C，D）。
图3 AD中PBMC细胞群的IRG评分
03 - 从批量测序数据获取AD组织的DEGs
为了研究AD中脑组织的表达特征，分析了包含310名AD患者和157名对照组的批量RNA测序数据集GSE33000，以探索AD大脑中的DEG，并筛选PBMC和脑组织之间的常见IRG，5339个上调和5542个下调的DEGs被保留在AD组织中（图4A）。图中显示了前100个上调和前100个下调的DEGs的热图，并观察到组内的相对一致性（图4B）。与AD的PBMC中NK簇的表达特征相似，AD组织中DEGs的前10个GO词也集中在免疫反应方面（图4C，D）。这些数据表明，AD PBMC中NK簇的DEGs与AD组织中的DEGs有相似的GO术语，表明NK细胞在AD患者组织中的潜在作用。
图4 来自GSE33000数据集的AD大脑的DEGs
04 - 共同的IRG和相关的调控转录因子
由于来自PBMC的NK簇中DEG的GO和来自AD大脑的DEG的GO主要集中在免疫反应上，作者进一步研究了外周NK细胞和AD组织的IRG的共同表达特征，在PBMC NK群和AD大脑中共发现了70个共同的IRG（图5A）。GSE33000中前40个常见IRG DEGs的表达主要在PBMCs的NK群中活跃（图5B）。
为了研究IRG的转录调控活性，从HumanTFDB获得了1665个TFs的列表，来自PBMCs的AD NK簇中的34个TFs和AD脑中的765个TFs被保留下来。此外，17个共同的TFs在AD外周NK群和AD组织中都有表达（图5C）。在所有的集群中，总共有1979个独特的标记基因被确定。对于NK集群，总共鉴定了778个标记基因，只有34个基因属于TFs。因此，外围NK标记基因、AD组织中的DEGs和TFs数据库之间的重叠TFs只有17个。这17个TFs在GSE33000和AD外周NK簇中的表达情况显示（图5D，E）。13个TFs在AD组织中被上调，所有17个TFs在NK和NKT细胞中都很活跃。PPI网络表明，STAT3可能在IRG的转录调控中作为一个枢纽基因发挥了关键作用（图5F）。
图5 常见的IRG和相关的调控转录因子
05 - 确认NK在AD组织中的浸润
为了确认NK细胞对组织的浸润，作者从GEO数据库中选择了scRNA测序数据集GSE142853，对3XTg-AD小鼠大脑中的分类NK细胞进行测序。共有3250个细胞，包括来自AD小鼠的1634个细胞和NC小鼠的1616个细胞，产生了十个簇（图6A）。AD组的第6个簇的百分比高于NC组（4.6% vs. 2.9%）（图6B）。细胞毒性分子（Cstd）、促炎症趋化因子（Ccl3、Ccl4）、粘附分子（Icam1）和NK细胞激活分子（Tbx21、Nfatc1、Nfkbia和Klra9）在簇6中高表达（图6C，D）。此外，SingleR和Celldex R软件包被用来注释这些集群，并使用分数计算预测的准确性。结果显示，GSE142853中的10个集群中有9个被注释为NK细胞，而一个集群被注释为小胶质细胞。NK和小胶质细胞的注释都被标记为黄色，代表较高的准确性（图6E）。tSNE图显示在3XTg-AD小鼠的大脑中，小胶质细胞的比例非常小，而NK细胞占大多数（图6F）。综上所述，GSE142853数据集证实了NK细胞在AD大脑中的出现，而且一些浸润的循环NK细胞在AD大脑中被激活。
图6 AD大脑中NK细胞的scRNA分析
四、结论
作者提出外周NK细胞可能渗入大脑，并利用生物信息学分析结合scRNA和批量测序数据对AD的神经炎症变化做出贡献。此外，STAT3可能参与了IRG、浸润和NK细胞激活的转录调节。
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