2023.4.14
本文记录从Genome-wide analysis of cytochrome P450 genes in Citrus clementina and characterization of a CYP gene encoding flavonoid 3′-hydroxylase文献中总结的基因家族分析步骤。这篇文章包含生物信息学分析和分子生物学试验，是典型的“干湿结合”，其文章结构和思路值得借鉴。本文主要记录生物信息学分析部分，包括柑橘中CYP基因的鉴定、蛋白的物理化学功能预测、预测亚细胞定位、进化树的构建、保守motif分析、基因结构分析、共线性和基因复制分析、启动子分析。
柑橘中CYP基因的鉴定
准备工作：从Phytozome v13 https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/ Cclementina_v1_0下载最新柑橘基因组。
1.从PFAM下载CYPs保守结构域对应的隐马尔可夫模型（HMM），使用HMMER（evalue=0.1）对柑橘蛋白数据库进行HMM搜索。
2.下载拟南芥中CYPs基因的氨基酸序列，作为query序列，在柑橘蛋白数据库进行本地Blastp搜索（e-value=1e-5）。
3.将以上两步得到的序列合并，去除重复。
4.通过NCBI Conserved Domain Database toolhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi验证序列保守结构域，得到柑橘中所有的CYPs基因。
蛋白的物理化学功能预测
5.利用ExPASy https://web.expasy.org/protparam/中的ProtParam工具计算CYPs的各种物理和化学参数，包括氨基酸数量、分子量、理论等电点、不稳定性指数、脂肪族指数等等。
预测亚细胞定位
6.利用BUSCAhttp://busca.biocomp.unibo.it/预测CYPs的亚细胞定位。
进化树的构建
7.使用MUSCLE或ClustalW进行序列比对（根据需要选择比对方式）（ClustalW的基本原理是首先做序列的两两比对，根据该两两比对计算两两距离矩阵，是一种经典的比对方法，使用范围也比较广泛。Muscle的功能仅限于多序列比对，它的最大优势是速度，比ClustalW的速度快几个数量级，而且序列数越多速度的差别越大）。
8.使用trimAl自动去除排列不齐的区域（这里也可以使用TBTools中的Trimmer快速修剪工具Quick Run TrimAL工具）。
9.使用MEGA或IQ-TREE（最大似然法/邻接法）构建进化树，使用ITOLshttps://itol.embl.de/美化。
保守motif分析
10.使用MEMEhttps:// meme-suite.org/meme/tools/meme识别CYPs保守motif基序（参数：number of motifs to find = 15; min motif width = 6; and max motif width = 50），，利用TBTools可视化。
基因结构分析
11.从柑橘基因组注释文件（gff3）中获得CYPs基因结构，包括外显子、内含子、CDS和UTR，利用TBTools可视化。
共线性和基因复制事件分析
12.使用MCScanX分析柑橘CYPs基因之间的共线性关系和基因复制事件；使用shinyCircos可视化CYPs基因对的同步区和重复事件。
13.使用TBTools生成基因密度分布，可用shinyCircos可视化。
14.使用TBTools中的Simple Ka/Ks Calculator实现Non-synonymous（Ka）/synonymous（Ks）计算。
15.使用TBTools将柑橘CYPs的基因位点定位到基因组的scaffolds。
启动子分析
16.每条基因ATG前2000bp作为启动子区域，使用PlantCAREhttps://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/预测顺式作用元件，使用TBTools可视化。
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