全长转录组 | 三代全长转录之circRNA（ONT ）-- C

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类特殊的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。

目前研究表明，在生物体内，circRNA主要通过其序列特征，发挥miRNA海绵、RNA-binding proteins （RBPs）海绵以及翻译短肽等生物学功能（1-2）。因此，确定其的全长序列，是进行circRNA功能研究的重要基础。由于目前对于circRNA的研究多采用二代测序的方法，而circRNA的内部序列与线性mRNA分子高度相似，单纯通过算法（识别反向剪切位点）很难区分来自环形RNA和线性RNA分子的读段，以及确定全长circRNA内部组成。近期的研究中利用了长读长测序技术，对circRNA的全长重构进行了尝试（3-4）。因此，目前研究方法对于circRNA结构的识别能力主要被二代测序的读长所限制，对于长度较长（>500bp）的circRNA分子，仍然缺少有效的全长重构手段。

赵方庆教授团队前期提出了CIRI-AS算法（基于BSJ读段对比结果对环形RNA内部可变剪接结构进行识别）。后续研究开发了CIRI-full算法（通过识别双端250bp测序数据中反向重叠区特征，对500bp以内的环形RNA进行全长重构）。上述方法主要基于短读长测序技术，难以对长度500bp以上的circRNA的全长序列进行有效识别。

在此基础上，2021年3月11日，中国科学院北京生命科学研究院赵方庆教授团队在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long 的文章，开发了一种基于三代纳米孔测序平台（Oxford Nanopore Technologies ，ONT）高效测定circRNA全长转录本的实验和计算方法：利用随机引物对circRNA进行的滚环反转录扩增后，使用三代纳米孔测序技术（ONT）对circRNA的全长序列进行直接测序，并开发了CIRI-long 算法，实现对长测序读段中的circRNA序列进行识别和全长重构。实验结果表明，与传统的circRNA二代测序技术相比，该方法将circRNA检测灵敏度提升了20倍，并可实现对不同长度（<100bp - 5kb）的circRNA全长序列的无偏识别，大幅提升了环形转录本的重构能力，为其功能研究提供了重要的实验方法和计算工具。

赵方庆教授实验室主页（图1）：https://bioinfo.biols.ac.cn/

图1.赵方庆教授实验室主页

一、CIRI-long软件介绍

因为circRNAs及其对应的线性信使RNA之间的相似性，利用短读长RNA测序重建circRNA的全长序列一直是具有挑战性的，先前的测序方法无法实现对全长circRNA的高通量检测。赵方庆教授团队开发了一种利用三代纳米孔（ONT）测序技术进行circRNA及其相应的异构体（isoform）富集和全长测序的方案。环状逆转录和片段大小选择能比先前方法从总RNA中多富集出20倍的circRNAs。我们开发了一个使用长度长测序数据（CIRI-long）circRNA鉴定软件，用于重建circRNAs的序列。该算法工作流程利用模拟数据，通过与 Illumina 测序以及定量实时RT-PCR 的比较进行了验证。作者使用CIRI-long来分析成年小鼠脑组织样本，并系统地对circRNAs进行注释分析，包括来自线粒体circRNAs。作者鉴定了一种新的内含子自连接circRNA的特殊的剪接和表达模式。此方法利用了三代纳米孔测序的长读长优势，实现了对全长circRNA序列的无偏重建（图2）。

图2. CIRI-long文章

二、CIRI-long的安装

依赖软件：

• gcc 4.8+ 或 clang 3.4+
• cmake 3.2+
• python>=3.7
• samtools=1.9 或更高
• minimap2

1. 从源代码安装

$ git clone https://github.com/bioinfo-biols/CIRI-long.git CIRI-long
$ cd CIRI-long

# Create virtual environment
$ python3 -m venv venv

# Activate virtualenv
$ source ./venv/bin/activate

# Install CIRI-long
$ make

# Test for installation
$ make test

2. 使用pip安装

个人推荐使用，方便快捷。

$ pip install CIRI-long

三、CIRI-long的使用方法

软件主页：https://github.com/bioinfo-biols/CIRI-long

1. 基本用法

CIRI-long两个命令: CIRI-long call 和 CIRI-long collapse，因此整个流程分为两步。

usage: CIRI-long [-h] [-v] {call,collapse} ...

positional arguments:
  {call,collapse}  commands

optional arguments:
  -h, --help       show this help message and exit
  -v, --version    show program's version number and exit

2. 步骤1：circRNA 鉴定

• 基本用法

#主命令
$ CIRI-long call [-h] [-i READS] [-o DIR] [-r REF] [-p PREFIX] [-a GTF] [--canonical] [-t INT] [--debug]

optional arguments:
  -h, --help            show this help message and exit  #帮助文档
  -i READS, --in READS  Input reads.fq.gz  #输入文件
  -o DIR, --out DIR     Output directory, default: ./  #输出文件夹路径
  -r REF, --ref REF     Reference genome FASTA file  #参考基因组ref.fa文件，需要用bwa进行索引
  -p PREFIX, --prefix PREFIX
                        Output sample prefix, (default: CIRI-long)  #输出文件前缀
  -a GTF, --anno GTF    Genome reference gtf, (optional) #基因组注释文件（可选）
  -c CIRC, --circ CIRC  Additional circRNA annotation in bed/gtf format, 
                        (optional)  #以bed/gtf格式输出circRNA注释文件（可选）
  -t INT, --threads INT Number of threads, (default: use all cores)  #线程数
  --debug               Run in debugging mode, (default: False)  #纠错模式运行

注意：
参考基因组需要bwa的索引。在运行CIRI-long之前，使用bwa index命令对参考基因组ref.fa文件进行索引。

• 使用示例

#下载演示数据
$ wget https://github.com/bioinfo-biols/CIRI-long/releases/download/v0.6-alpha/CIRI-long_test_data.tar.gz

#演示数据解压
$ tar zxvf CIRI-long_test_data.tar.gz
$ cd test_data

#使用```bwa index```命令对参考基因组文件进行索引
$ bwa index -a bwtsw mm10_chr12.fa mm10_chr12.fa

#运行CIRI-long鉴定circRNA
$ CIRI-long call -i test_reads.fa \  #输入文件
               -o ./test_call \ #输出路径
               -r mm10_chr12.fa \ #参考基因组
               -p test \ #输出文件前缀
               -a mm10_chr12.gtf \ #基因组注释文件
               -t 8 #使用线程数

• 输出文件

test_call
├── test.cand_circ.fa  # 主要文件，circRNA序列文件。
├── test.json
├── test.log
├── test.low_confidence.fa  # circRNA序列文件，低置信度。
└── tmp
    ├── ss.idx
    ├── test.ccs.fa
    └── test.raw.fa

# 如果不加 -c 选项，则产生一个文件夹，7个文件

• 使用非经典剪切信号
  如果想使用其它剪切信号，可以在脚本align.py修改SPLICE_SIGNAL，格式为：{(5’SS, 3’SS): Priority} 。

默认：

SPLICE_SIGNAL = {
    ('GT', 'AG'): 0,  # U2-type
    ('GC', 'AG'): 1,  # U2-type
    ('AT', 'AC'): 2,  # U12-type
    ('GT', 'AC'): 2,  # U12-type
    ('AT', 'AG'): 2,  # U12-type
}

3. 步骤2：isoform合并（collapose）

• 基本用法

可以将多个样本的circRNA结果合并。

#主命令
$ CIRI-long collapse [-h] [-i LIST] [-o DIR] [-p PREFIX] [-r REF] [-a GTF] [--canonical] [-t INT] [--debug]

optional arguments:
  -h, --help            show this help message and exit  #帮助文档
  -i LIST, --in LIST    Input list of CIRI-long results  #样本名称和路径的list文件
  -o DIR, --out DIR     Output directory, default: ./  #输出文件夹路径
  -p PREFIX, --prefix PREFIX
                        Output sample prefix, (default: CIRI-long)  #输出文件前缀
  -r REF, --ref REF     Reference genome FASTA file   #参考基因组文件
  -a GTF, --anno GTF    Genome reference gtf, (optional)  #参考基因组注释文件
  -c CIRC, --circ CIRC  Additional circRNA annotation in bed/gtf format,
                        (optional) #以bed/gtf格式输出circRNA注释文件（可选）
  -t INT, --threads INT
                        Number of threads, (default: use all cores)   #线程数
  --debug               Run in debugging mode, (default: False)  #纠错模式运行

需要先创建一个想要合并样本（*.cand_circ.fa）的名称和路径的list文本文件，以空格分隔。

#list 文件内容
sample1_name /path/to/sample1/cand_circ.fa
sample2_name /path/to/sample2/cand_circ.fa

• 使用示例

创建一个名为test.list文本文件：

test ./test_call/test.cand_circ.fa

运行CIRI-long collapse合并一个或多个样本结果。

 $ CIRI-long collapse -i ./test.lst \  #输入文件
                    -o ./test_collpase \  #输出文件夹路径
                    -p test \  #文件前缀
                    -r ./mm10_chr12.fa \   #参考基因组
                    -a ./mm10_chr12.gtf \  #参考基因组注释文件
                    -t 8   #线程

• 输出文件

test_collpase
├── test_collpase.expression
├── test_collpase.isoforms
├── test_collpase.info
├── test_collpase.log
├── test_collpase.reads
└── tmp
    ├── ss.idx
    └── test_collpase.corrected.pkl

# 如果不加 -c 选项，则产生一个文件夹，6个文件

• 输出文件格式

1）主要输出文件，GTF格式文件（test_collpase.info），包含所有circRNA的详细信息和circRNA反向剪切区域的注释列。

列	名称	描述
1	chrom 染色体位置	chromosome/contig name ---- 染色体或contig名称
2	source 来源	CIRI-long
3	type 类型	circRNA
4	start 起始	5' back-spliced junction site ---- 5'端反向剪切位点
5	end 结束	3' back-spliced junction site ---- 3'端反向剪切位点
6	score 得分	Number of total supported reads ---- 支持reads数
7	strand 链	strand information ---- 链信息
8	.	.
9	attributes 特性	attributes seperated by semicolon ---- 分号分隔的属性

属性列包含了几个预先定义的关键词及其赋值：

key关键词	description描述
circ_id circRNA的ID	name of circRNA ---- circRNA名称
splice_site 剪切位点	splicing signal of candidate circRNAs and numbers indicating shifted bases of aligned and annotated splice site. (e.g. AG-GT | 0-5) 候选circRNA剪切信号和实际剪切位点和注释的偏差碱基数
equivalent_seq 等同序列	equivalent sequence of splice site ---- 同一个剪切位点对应的其它circRNA序列
circ_type circ类型	circRNA types: exon/intron/intergenic ---- circRNA类型：外显子/内含子/基因间区
circ_len circ长度	length of the major isoform of circRNA ---- circRNA主要异构体的长度
isoform 异构体	structure of isoforms, isoforms are seperated by "|" and circular exons are seperated by "," (e.g. 11627815-111627914,111628190-111628302|11627815-111628302) ---- circRNA异构体的位置长度信息
gene_id 基因ID	ensemble id of host gene ---- 基因的ensemble ID
gene_name 基因名称	HGNC symbol of host gene ---- 基因的名称
gene_type 基因类型	type of host gene in the annotation gtf file ---- 基因的类型

2）表达矩阵

test_collpase.expression: 包含所有样本中circRNA的表达水平，tsv文件格式。

test_collpase.isoforms:包含所有样本中每个circRNA异构体（isoform）使用指数（index），tsv文件格式。

isoform使用指数公式：

Isoform usage index = Isoform_reads（某个异构体-isoform的数量） / Sum of all isoforms from the same BSJ (共享同一个反向剪切位点的所有异构体-isoform总和)

4. 步骤3：输出文件可视化

从版本v1.1.0以后，CIRI-long包含misc/conver_bed.py 脚本，用户可以使用此脚本将 circRNA.info（gtf格式）转化为.bed格式，此.bed文件可以利用IGV或Jbrowse2软件进行可视化。具体转化代码如下：

$ python3 misc/convert_bed.py collapse_out/sample.info sample_circ.bed

四、参考文献

1. 专家点评 | 基于纳米孔测序的环形RNA识别和重建新技术
2. Chen L-L. The Expanding Regulatory Mechanisms and Cellular Functions of Circular RNAs. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 2020.
3. Zheng Y, Ji P, Chen S, et al. Reconstruction of Full-Length Circular RNAs Enables Isoform-Level Quantification. Genome Medicine, 2019, 11(1): 4. Xin R, Gao Y, Gao Y, et al. IsoCirc Catalogs Full-Length Circular RNA Isoforms in Human Transcriptomes. Nature Communications, 2021, 12(1): 266.
4. Zhang, J., Hou, L., Zuo, Z., Ji, P., Zhang, X., Xue, Y., & Zhao, F. Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Nature Biotechnology. (2021).
5. CIRI-long 使用文档： https://ciri-cookbook.readthedocs.io/en/latest