博士课题换到了肿瘤免疫相关方向，涉及到T细胞培养的问题，简单查了下发现用的培养基五花八门，用实验室级别的也有工业GMP生产用的培养基，一时不知如何下手。查找了几篇文献，发现实验室常用的就是1640、DMEM:F12、AIM-V和X-VIVO，有些文章中会在培养基中添加人AB血清而不是FBS。
但是这些培养基对T细胞表型、亚型和生长有何影响，还是不得而知。幸好查到两篇文章，解答了我上述的疑惑，本文内容基本全部来自这两篇文章，在此同大家分享，也希望有T细胞培养经验的大佬能够多指导。
两篇文章虽然影响因子不高，但通讯作者都是T/CAR-T领域资深的专家，有多篇高分文章发表，所以还是有很多参考价值的，以下是文章连接：
👉Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T Cells by a Serum-free Medium
👉Influence of various medium environment to in vitro human T cell culture
1 T细胞培养基发展史
培养基对于细胞的重要性不言而喻，不同的培养基可能会导致不同的表型变化。对于普通细胞尚且如此，更何况要研究免疫效应的T细胞。T细胞有着众多亚型，不同的培养基可能对不同的亚型有着更为强大的扩增能力，我们需要找到能够合适扩增想要的亚群的培养基。成功的免疫治疗取决于选择合适的培养基来支持所需T细胞类型的有效扩增。 目前常用T细胞培养基：1640+human serum、AIM V 和 X-VIVO。因为人血清难以获得，所以开发的T细胞培养基都是无血清培养基，即不添加血清即可使用。 CTS OpTmizer SFM和T-VIVO分别是Gbico和Lonza推出的针对工业界GMP生产CAR-T之类T细胞的培养基。
图1 T细胞培养基发展史
2 培养基对T细胞扩增的影响
T细胞扩增需要IL-2及CD3/CD28Beads的刺激，下图是来自两篇文章的实验对比，其中1B2H是James L. Riley实验室开发的培养基，可以忽略，未查到商品化的该培养基。
可以看到，添加血清与否，X-VIVO表现都还不错
图2 Medvec AR. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017
图3 此图AIM V中添加了人血清 Xu, H. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 2018
3 培养基对T细胞凋亡的影响
在 CD3/CD28 刺激下培养 T 细胞时（图 4b），AIM-V 组细胞凋亡率最低（第 3 天为 10.4 ± 2.0%，第 7 天为 16.8 ± 7.5%），SFEM 组细胞凋亡率最高（第 3 天为 41.2 ± 3.1%，第 7 天为 67.9 ± 2.7%），而OpTmizer组的细胞凋亡率次之（第3天为14.3±3.0%，第7天为27.2±4.7%），X-VIVO组次之（第3天为31.7±3.0%，第7天为44.3±4.2%）。 因此，与 X-VIVO 相比，我们认为 OpTmizer 和 AIM-V 是更好的 T 细胞培养环境，因为事实证明 T 细胞在前两种培养基中的存活率更高。（注意这里 AIM-V是添加了人血清的）
图4 第3天和第7天，在有 CD3/CD28 刺激（b）和无 CD3/CD28 刺激（a）的情况下 Xu, H. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 2018
4 培养基对T细胞表型的影响
我们研究了在 IB2H 或 X-VIVO 15 中扩增的 T 细胞的表型。有趣的是，1B2H 支持扩增不表达 CCR7 和/或 CD27 的 CD4 T 细胞，其次是 CD8 T 细胞（图 5A-5C）。对这一数据的一种解释是，1B2H 能更有效地扩增高度分化的 T 细胞；另一种解释是，在 1B2H 中扩增的分化程度较低的 T 细胞能更快地转化为效应 T 细胞。为了区分这些可能性，我们对天真和 T EM CD4 T 细胞进行了分拣，并在有或没有人血清的情况下用 1B2H 或 X-VIVO 15 扩增了它们。 我们观察到，幼稚T细胞在1B2H培养基中的扩增效果更好，加入人血清也不会改变T细胞在这两种培养基中的生长（图5D）。另一方面，在没有血清的情况下，效应 T 细胞在 X-VIVO 15 培养基中的增殖效果不佳，但在有血清的情况下却能增殖。相反，1B2H 中的效应 T 细胞在血清存在或不存在的情况下都会发生同等的扩增（图 5E）。我们还检查了扩增后纯化 T 细胞群的表型。无论使用哪种培养基，纯化的幼稚 T 细胞都能保持较高的 CCR7 和 CD27 表达，但在有血清存在的情况下扩增的 T 细胞比无血清扩增的 T 细胞能更好地保持这些标志物（图 5F 和 5G）。 在1B2H（有血清和无血清）或X-VIVO 15（有血清）中扩增的T EM T细胞保持了T EM 表型（图5H和5I），而在X-VIVO 15（无血清）中生长的T CM T细胞群富集了，这表明在X-VIVO 15（无血清）中观察到的部分扩增是由污染的T细胞引起的。这些数据共同表明，1B2H 可以在无血清的情况下扩增幼稚 T 细胞和 T EM T 细胞，而 X-VIVO 15 作为无血清培养基只能扩增幼稚 T 细胞。此外，用 1B2H 扩增的 T 细胞比用 X-VIVO 15 扩增的 T 细胞更能保持其最初的 T EM 表型。
图5 Medvec AR. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017
在弄清6种培养基中T细胞的各种功能后，我们重点研究了T细胞在不同培养环境中的表型随时间的变化。同样，在 6 种培养基中培养 T 细胞时，我们将它们进一步分为 CD3/CD28 组和非 CD3/CD28 组，并分别在第 0 天、第 3 天和第 7 天对细胞进行分析。首先，在第 7 天结合 CD3/CD28 刺激时，观察到从 CD8 细胞为主转变为 CD4 细胞为主（图 6a）。为了确定 CD4 和 CD8 T 细胞的特定亚型，我们用标记物 CD45RA、CD45RO 和 CCR7 评估了 T 细胞的成熟度，发现加入 CD3/CD28 刺激后，表型的变化遵循一定的模式，与培养基无关。 在 CD4+ T 细胞中，大部分 Tn 被 Tef 和 Tem 取代，导致在 CD3/CD28 刺激下 Tn 的比例显著下降。据观察，Tcm 的比例保持在同一水平（图 6b）。与 CD4 + T 细胞组相似，CD8 + T 细胞组中 Tn 的比例也有所下降，并被 Tem 和 Tef 所取代。而 Tcm 细胞在 CD8+ 组中只占极低的比例（图 6c）。这一现象代表了 T 细胞在特定刺激下被激活后的成熟过程。 最后，我们评估了观察期间表型的变化模式。以 OpTmizer 组为例（图 6d），随着观察的进行，Tn 不断向其他亚群分化，而 CD4 和 CD8 Tcm 的比例水平保持不变，这也表明 T 细胞在培养过程中不断成熟。
图6 (a) 显示第 7 天 CD3/CD28 刺激和未刺激时 CD4 和 CD8 T 细胞的比例。第 7 天 CD4（b）和 CD8（c）的成熟阶段根据以下表型组合确定：Tn（幼稚 T 细胞）：CD3+CD45RO-CD45RA+CCR7+，Tcm（中心记忆 T 细胞）：CD3+CD45RO+CD45RA-CCR7+，Tem（有效记忆T细胞）：CD3+ CD45RO + CD45RA-CCR7-，Tef（有效记忆 T 细胞）：从基线到第 3 天和第 7 天（d），OpTmizer 中 T 细胞的成熟阶段发生了变化。 Xu, H. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 2018
5 T细胞培养基的选择
| 名称 | 规格 | 货号 | 厂家 | 价格(元) | 货期 |
|---|---|---|---|---|---|
| AIM V 培养基 | 500 ml | 12055091 | Gibco | 970 | 现货 |
| X-VIVO 15 | 1000 ml | LONZA | 650 | 现货 | |
| CTS OpTmizer SFM | 1000 ml | A1048501 | Gibco | 2500 | 现货 |
| 人血清 | 100 ml | S7023 | Sigma | 3387 | 货期不定 |
Successful immunotherapy depends on the selection of appropriateculture media to support efficient expansion of the type of T celldesired.
Sato K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 2009
可见培养基对于T细胞的影响还是巨大的，还需要根据自己的实验目的进行一定的选择。由于人血清较为难以获得，基于以上结果，综合价格等因素，我个人选择了X-VIVO 15作为培养基，尝试看能不能得到较好的结果。建议同时订购人血清作为候补。
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