近日，复旦大学附属中山医院樊嘉院士课题组，第一作者祝桂琦在期刊Cell Discovery（IF：38.079）上发表了题为CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellular carcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor的研究论文，在肝癌中报道了特定CAF亚群功能，从而很好的理解了肿瘤微环境和免疫系统之间相互作用。该文章中流式分选单细胞转录组测序工作及部分单细胞转录组测序由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海国家工程研究中心）提供服务。
摘要
肝细胞癌(HCC)是一种具有高度细胞异质性的免疫治疗耐药恶性肿瘤。细胞类型的多样性以及肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的相互作用仍有待阐明。人类和小鼠HCC肿瘤的单细胞RNA测序显示癌症相关成纤维细胞(CAF)的异质性。跨物种分析发现CD36+ CAFs表现出高水平的脂质代谢和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)表达。此外，CD36在CD36+ CAFs中通过脂质过氧化/p38/CEBPs轴介导氧化性LDL摄取依赖的MIF表达，CD36+ CAFs以MIF和CD74依赖的方式招募CD33+髓源性抑制细胞(MDSCs)。CD36+ CAFs与HCC细胞共植入促进HCC在体内的进展。最后，CD36抑制剂与抗PD -1免疫治疗协同作用，通过恢复HCC中的抗肿瘤T细胞反应。研究者的工作强调了阐明特定CAF亚群功能在理解肿瘤微环境和免疫系统之间相互作用的重要性。
技术路线
文章详情
文章题目：CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellular carcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor
中文题目：CD36+癌相关成纤维细胞通过分泌巨噬细胞迁移抑制因子为肝细胞癌提供免疫抑制微环境
发表时间：2023.03
期刊名称：Cell Discovery
影响因子：38.079
DOI：10.1038/s41421-023-00529-z
组学技术：单细胞测序
研究思路
1. 单细胞分析揭示了人类HCC肿瘤的复杂性
研究者对来自未治疗的HBV（慢性乙型肝炎病毒）相关HCC患者的7个肿瘤和其中4个患者的相邻肝组织进行了单细胞测序，并对90572个细胞进行了后续分析。共分成了9个细胞群：上皮细胞和肿瘤细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)、单核细胞或巨噬细胞、树突细胞、成纤维细胞和内皮细胞。随后研究者对7个HBV相关的HCC组织的scRNA-seq分析中CAFs进行了分类，共聚类成5个亚群。Cluster 0以特征微血管系统基因为特征，被命名为血管CAFs (vCAFs，vCAFs-c0-MYH11)；Cluster 2表达低水平α-SMA和高水平细胞外基质(ECM)特征，被命名为基质CAFs (mCAFs，mCAFs-c2-LUM)；Cluster 1与mCAFs-c2-LUM相似，也表达高水平的COL6A3和COL1A1以及高水平的脂质代谢相关基因，被命名为脂质加工(lp)-mCAFs (lpmCAFs, lpmCAFs-c1- CD36)；Cluster 3表达高水平的脂质加工markers，被命名为脂质加工CAFs (lpCAFs, lpCAFs -c3- APOA1)；Cluster 4表达主要组织相容性复合体II (MHCII)基因以及趋化因子相关基因，被命名为抗原呈递CAFs (apCAFs, apCAFs-c4- HLA - DRA)。为了探讨不同病因引起的CAF亚型的异质性，研究者还对7例非HBV相关HCC肿瘤进行scRNA-seq，发现与HBV相关HCC相比，非HBV HCC(包括酒精性、脂肪肝或药物性HCC)中CD36+ CAFs和lpCAFs的比例明显降低，这可能是HBV蛋白诱导的HBV相关HCC13中的脂质代谢和氧化应激引起的。
图1 人类HBV相关HCC中不同的成纤维细胞亚群
2. 小鼠HCC肿瘤中CAF亚型的单细胞分析
研究者构建了肝癌小鼠模型，随后对10个肿瘤小鼠进行了单细胞分析，共聚类成10个细胞群。与人类HCC相似，小鼠HCC肿瘤含有大量的髓系细胞(~30%)，主要由巨噬细胞和MDSCs组成，还有少量的DC。为了进一步鉴别成纤维细胞的异质性，研究者从7个小鼠肝癌肿瘤的scRNA-seq分析中筛选出CAFs，并聚类成了7个亚群。并且在人类HCC肿瘤中发现的所有5种CAF亚型在小鼠HCC组织中也有表达。
图2 小鼠HCC组织中不同的成纤维细胞亚群
3. 小鼠和人类HCC组织中CAFs的空间异质性
研究者进行了mIF检测，发现CD36+ CAFs在人类和小鼠HCC肿瘤的肿瘤核心区域比肿瘤周围区域更富集，他们使用荧光激活细胞分选(FACS)分离人相邻肝组织中的成纤维细胞，并发现细胞可以聚类为相同的5种CAF亚型，并且CD36+ CAFs在HCC肿瘤中特异性富集，而vCAFs在肿瘤中的数量略高于邻近肝组织。
4. 不同CAF亚群的细胞状态转变轨迹
通过Monocle 2推断的状态转换轨迹包含两个谱系，呈现出从始祖状态到终端效应状态的分叉结构。lpmCAFs (CD36+ CAFs)处于中间状态，最终分化为vCAFs、lpCAFs和apCAFs，这是一个向终端效应状态的动态转变，包括血管平滑肌收缩、脂质代谢和以MUSTN1、APOC1和CD74表达为特征的抗原呈递过程。在小鼠中也有同样的发现，并且与脂质代谢和抗原呈递过程相关的转录因子(TFs)，如CEBPA、MAFB和IKZF1随着轨迹分化过程逐渐上调。相反，CEBPB，NFIC，TWIST1和CREB3L1在整个过程中被下调。
5. 不同CAFs与MDSCs的相互作用及其机制
研究者通过细胞互作分析，在9个细胞组中检测到71个显著的配体-受体对，这些配体-受体对被进一步分为25个信号通路，包括TGFβ、非典型WNT (ncWNT)、TNF、SPP1、PTN、PDGF、CXCL、CCL和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)通路。跨物种分析显示，MIFCD74/CXCR4在CAFs与其他细胞的相互作用中排名第一。推断的MIF信号网络进一步揭示了肿瘤细胞和CAFs是MIF配体作用于MDSCs、单核或巨噬细胞和DC的主要来源。此外，lpmCAFs和lpCAFs是最突出的MIF配体来源。
6. CAF亚型特异性转录因子和基因调控网络
研究者应用SCENIC分析发现vCAFs在MEF2C和FOS中富集，这在之前被认为可以调节新血管生成。TWIST1和CREB3L1是mCAFs中表达高的TFs。lpmCAFs (CD36+ CAFs)显示CEBPD高表达，这是一种已知的控制脂质代谢和EMT24相关转录程序的关键调控因子。除了CEBPD外，lCAFs还显示了CEBPA和MAFB的高表达。最后，apCAFs显示IKZF1和RUNX3的高表达，这与巨噬细胞极化和T细胞募集有关。研究者同样检测了在小鼠CAF亚群中活跃的主调控因子，结果显示Mef2c和Foxf1是小鼠vCAFs中活跃的TF基因，与人类vCAFs相似。同样，Twist1、Cebpd、Cebpa和Ikzf1也分别是小鼠mCAFs、CD36+ CAFs、lpCAFs和apCAFs中的活性TF。
7. CD36+ CAFs在HCC肿瘤中与MDSCs接近
研究者探究CD36+ CAFs与TME内效应T细胞和MDSCs之间是否存在相关性。他们的scRNA-seq数据和TCGA数据显示CD36+ CAFs与MDSCs呈正相关，但与效应T细胞(GZMB+ CD8+)呈负相关。此外，研究者对12例HCC肿瘤进行单细胞核测序(snRNA-seq)，发现CD36+ CAFs的数量与MDSCs呈正相关。mIF染色显示CD36+ CAFs比CD36 - CAFs更接近MDSCs。这些结果表明CD36+CAFs可能在HCC中具有有效的免疫抑制作用。
图3 CAF亚型特异性TF以及不同CAFs与MDSCs之间的相互作用
8. CD36在CD36+ CAFs中通过脂质过氧化/p38/CEBPs轴介导OxLDL摄取促进MIF表达
为了测试不同CAF产生的MIF水平，研究者通过FACS分离出不同的CAF亚型。进一步的qPCR和ELISA实验表明CD36+ CAFs来源的MIF表达明显高于vCAFs、mCAFs、apCAFs和HSCs来源的MIF表达。OxLDL是磷胆碱的另一个丰富来源(OxPL)，肿瘤间质液中OxPL含量高于循环系统。OxLDL以剂量依赖的方式增强CD36+ CAFs中的脂质过氧化。氧化应激，包括脂质过氧化，可以激活p38激酶及其下游信号通路。研究者发现，OxLDL在CD36+ CAFs中诱导p38磷酸化，但在CD36kd CAFs中诱导的程度要小得多。此外，p38磷酸化在CD36+ CAFs中的富集程度高于CD36kd或CD36-阴性CAFs。这表明OxLDL通过CD36和脂质过氧化促进p38激活。且在OxLDL存在的情况下，p38抑制部分挽救了MIF的分泌。研究者应用SCENIC分析发现对脂质代谢至关重要的CEBP家族(CEBPA和CEBPD)TF在CD36+ CAFs(包括lpmCAFs和lpCAFs)中特异性富集。当CEBPA和CEBPD分别沉默时，在OxLDL处理的CD36+ CAFs中MIF显著降低。染色质免疫沉淀(ChIP)显示CEBPA和CEBPD可以直接与MIF启动子结合。
图4 CD36在CD36+ CAFs中通过脂质过氧化/p38/CEBPs轴介导OxLDL摄取促进MIF表达
9. CD36+ CAF衍生的MIF通过IL-6/STAT3激活增强MDSCs促进免疫抑制TME和肿瘤干性的能力
据报道，MIF可诱导肿瘤内单核细胞MDSC的积累。且单核细胞MDSCs能够抑制抗原特异性和非特异性T细胞增殖，而T细胞增殖促进肿瘤生长和转移。研究者研究表明MIF分泌是CD36+ CAFs调节MDSC扩张的关键中介。随后，他们在免疫功能正常的小鼠中使用原位肝癌模型，证明了共注射从小鼠肝癌肿瘤中分离的CD36+ CAFs(~30:1)显著促进小鼠肝脏中肝癌肿瘤细胞的生长或转移，这种作用因CD36特异性下调、MIF抑制或Gr-1+ MDSCs耗竭而大大减弱。研究者之后也探究了CD36+ CAFs是否可以通过iNOS信号通路使MDSCs增强其免疫抑制能力。总的来说，这些结果表明CD36+ CAFs通过旁分泌MIFCD74轴以成纤维细胞CD36依赖的方式增强CD33+ MDSCs的干性增强能力。最后，为了探索CD36+ CAF衍生的MIF影响MDSCs的分子机制，研究者进行了RNA测序，比较了MDSC-MIF组和MDSC组。
图5 CD36+ CAF衍生的MIF通过IL-6/STAT3激活增强MDSCs促进免疫抑制TME和肿瘤干性的能力
10. 靶向CD36与免疫治疗在HCC小鼠模型中的协同作用
接下来，研究者建立了敲除小鼠模型进一步研究CD36+和MIF+ CAFs是否在HCC的发生中起作用，他们还探究了接受新辅助抗PD -1治疗的患者切除的HCC组织中的CD36+ CAFs。结果显示，抗PD -1应答组CD36和α-SMA共表达低于无应答组，表明CD36+ CAFs数量低预示着更好的HCC免疫治疗应答。研究者还探讨了单一药物(CD36抑制剂或抗PD-1治疗)和联合治疗策略(CD36抑制和抗PD-1治疗)在小鼠模型和他们建立的抗PD1耐药HCC中的疗效。结果见下图。
图6 CD36+ CAFs预测肝癌免疫治疗的疗效，靶向MIF与肝癌小鼠免疫治疗协同作用
主要结论
研究者的发现在单细胞水平上提供了一个全面的HCC转录组景观，并确定了脂质过氧化诱导CD36+ CAFs分泌的MIF调节肿瘤细胞免疫逃避的新机制。靶向CD36可有效提高免疫治疗的疗效。需要进一步的研究来确定诱导不同CAF亚型形成和激活的瘤内信号，并确定其他CAF亚型在TME和肿瘤免疫中所起的作用。
文章亮点
通过单细胞测序发现人和小鼠HCC肿瘤CAF亚群具有显著异质性， 并在空间上发现CD36+ CAFs（lpmCAFs）细胞群在肿瘤区域明显富集；
通过轨迹分析、细胞互作分析、转录因子分析发现CD36+ CAFs与MDSCs具有显著相关性并通过MIF信号网络影响；
通过实验及分析发现CD36在CD36+ CAFs中通过脂质过氧化/p38/CEBPs轴介导OxLDL摄取促进MIF表达；
通过原位肝癌小鼠模型及细胞共培养验证了CD36+ CAF衍生的MIF通过IL-6/STAT3激活增强MDSCs促进免疫抑制TME和肿瘤干性的能力；
通过敲除小鼠模型发现了靶向CD36与免疫治疗在HCC小鼠模型中的协同作用。
参考文献：
Zhu GQ, Tang Z, Huang R, Qu WF, Fang Y, Yang R, Tao CY, Gao J, Wu XL, Sun HX, Zhou YF, Song SS, Ding ZB, Dai Z, Zhou J, Ye D, Wu DJ, Liu WR, Fan J, Shi YH. CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellular carcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor. Cell Discov. 2023 Mar 6;9(1):25. doi: 10.1038/s41421-023-00529-z. PMID: 36878933; PMCID: PMC9988869.
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