To destroy is easier than to create，摧毁总比创造要简单，这句话转换到基因编辑上就是：knockout比knock in容易。因为knockout只要摧毁基因，而knockin则是要创造一个新的“基因”，这个新”基因“不仅仅正确表达，还需要有相应的功能。换言之，knockout是non-specific，而knockin则是specific。
对于干细胞、悬浮细胞、原代细胞以及静息状态的细胞而言，转染已经相当困难，基于转染方式的knockout则是难上加难，而knockin则是上下左右为难。假如你的课题需要knockin一些特殊标记，而且不止一次需要knockin一次，那么有没有什么讨巧的办法既可以减轻工作量，又可以specific？今天我们就来讲重组酶介导的盒式交换 （recombinase-mediated cassette exchange，RMCE），个人关于这个技术的描述是：换药不换汤。
本文的1、2点是基因重组背景知识和gateway重组的介绍，如不需要，可直接跳到第3点，直达RMCE（宁可不看一二，也绝不能错过三）。
1. 基因重组recombination
在动笔写这篇文章RMCE之前，突然发现目前我们用到的几乎所有基因编辑手段，都是一种特定生物学过程的结果，那就是--重组（Recombination）。例如我们在前面的文章中有提到过HDR（Homology directed repair）介导的CRISPR-Cas9技术，就是依赖基因的同源重组，将供体片段替换到基因组中；此外，在piggyBac文章中提到的基因转座 （Transposition）*：DNA从某一位置移动到基因组上另一位置，也属于基因重组的范畴，并且是一种高度特异的基因重组。因此，在我们了解RMCE之前，需要加强一遍重组在我们基因编辑技术知识谱系的重要程度。
Recombination的分类
一类：自然发生的重组类型至少有以下四种：
（1）General or homologous recombination（常规/同源重组）：发生在序列非常相似的DNA分子之间，如二倍体生物中的同源染色体。同源重组是TELEN以及HDR介导的CRISPR-Cas9的基因编辑的基础，由于这种方法需要供体包含有非常长的同源臂，从而可以达到精准的效果，但精准度越高，其成功率又随之降低。
（2）Illegitimate or nonhomologous（不合理/非同源重组）：由于这种重组方法并不需要有长同源序列，看起来“不合理”， 所以被称之为不合理（非法）重组。这种重组可造成随机突变，在科学研究中也有用到。
（3）Site-specific recombination（位点特异性重组）： 顾名思义，就是需要有特定的识别位点才能开启的重组方式，而这些特定的识别位点通常长度在几十bp左右，gateway recombination和今天我们要讲的RMCE则属于这种，由此可以想象一下RMCE也需要独特的识别位点。
（4）Replicative recombination：可以看到复制性转座属于这种类型。
types-of-recombination
二类：人为改造/创造的重组类型：
（1）Plasmid Insertion Recombination（质粒插入重组）：在体外使用核酸酶可对质粒进行酶切，使用连接酶可将质粒和DNA片段重组连接。其人为性不仅仅是因为这是体外实验，同时人类也可以使用PCR的方式合成出相应的酶切位点，从而增加质粒的可编辑性，这对于大家来说就是家常便饭。
（2） Gene Gun Recombination（基因枪重组）： 主要用于植物工程，将包裹在金粒子上的DNA分子轰入活细胞中，最后该DNA溶液就可并入细胞的基因组中。这是一种物理改变DNA传递方法，同时基因传递的方法有以下几个分类：
gene delivery methods
从基因枪的原理我们理解到，改变DNA的传递方法，也是一种人为的重组方式。因此上图还将（3） Virus Replication Recombination（病毒复制重组）和（4）电转等等重组方式展现出来，这里就不再细说。
2. Gateway recombination
2.1 Gateway 介绍
Gateway重组是常用质粒元件置换方案，主要用于将目的元件在不依赖于核酸酶的方式，置换到想要的backbone上。前面说到，CRISPR-Cas9是从噬菌体侵入细菌时细菌的抵抗得到启发，而gateway重组也是一个向自然界学习的典型例子。λ噬菌体在整合因子（IFN，Int）的帮助下，将自身的attP位点和大肠杆菌的attB位点进行位点特异性重组，从而将自身的基因组整合到大肠杆菌中，此时attB & P产生两个新位点：attL & R。因此人们从这上得到启发，将att位点克隆到质粒中，这样就可以轻松置换两质粒的原件，从而达到“换药不换汤”的目的。
gateway
从上图可知：
（1）att位点的相关特性。
（2）以右图为例，现想要将左边紫色骨架质粒的CaMPARI原件置换到右边黄色骨架质粒上，由于两个骨架质粒有可以互相重组的attL1 & attL2位点。将两种质粒放在同一个反应系统中，使用LR clonase，即可轻松将CaMPAR从紫色骨架转移到黄色骨架上，从而得到一个新质粒。而ccdB是一个自杀基因，当细胞被转入带有ccdB的质粒后，大肠杆菌将不再生长，因此平板/培养基只剩下含有目标质粒的大肠杆菌。attL1 & L2重组后形成attP1 & P2的新位点。
（3）这种元件置换的方法，归根结底就在于供体和受体之间具有可重组的识别位点，按照这样的思路，人们可以将多种特殊的识别位点包装为元件置换系统。
2.2 Gateway recombination实战
目的：给质粒插入RFP标签
（1）挑选质粒
供体质粒：mRFP1Rab5 ；
目标质粒：pDONR-P2r-P3
（2）使用snapGene完成模拟
gateway_training
3. Recombinase-mediated cassette exchange重组酶介导的盒式交换
3.1 如何做到换药不换汤
终于回到开头，在knockin本身就很难的情况下，课题设计还需要多个knockin。如何做到只knockin一次，后面的”knockin“全部由RMCE完成。以上gateway recombination只是开胃小菜，gateway主要用于体外构建载体，而RMCE则可在体内达成元件转换的作用。上一节我们了解到元件置换的基本原理就是：需要特点识别位点+特定的重组酶。活细胞及生物体内用到的位点特异性重组系统就是大名鼎鼎的Cre-loxP、Flp-FRT以及Dre-rox。以Cre-loxP系统为例:
Cre-loxP2
看到上面的图是不是感觉很混乱并不好记忆，为什么loxP方向相同是倒置，相反是敲除或者移位。很多文章会告诉上图的内容，但根本的原因是loxP相当于影子分身，每个之间都可以互换，而且换的时候要求完全一样（影子分身能不一样？）。
我们想象一下上图deletion的状况，loxP-gene-loxP片段被Cre酶切除出来后可能出现的结果：
（1）左右两个loxP由于还可以和切除位点互补重组，因此，切出来的loxP-gene-loxP片段再次被重组回去，其结果就是，切了跟没切一样。因此，再次印证了一句话，切开只是第一步，DNA repair才是决定结果的关键一步
（2）按道理左边loxP被Cre切开后，重组时应该结合自己原来残留的缺口，但正是因为长得一样，它认错了，把右边loxp剩下的缺口给占用了，导致gene-loxP片段被挤出基因组，此时就达到了敲除的效果。
根据以上描述，我们想知道，怎样才能解决，切了相当于没切的问题呢？
3.2 loxP位点的变异体
在gateway中我们学到，att位点可有多种变体，同样loxP位点也是，如下图所示，不同loxP位点之间也有特定的重组方式和亲和力 [2]。可以看到：
（1）野生型loxP可以和包括自己在内的所有loxP突变体进行重组。
（2）大部分loxP变体只能和少数loxP变体进行重组，例如：loxP66可以和loxP71、511等进行重组，最后形成相应的loxP位点。
（3）少部分loxP变体只能和自己进行重组，例如lox2272，每一种loxP变体的出现，都是在完善和扩大Cre-loxP系统，使之可使用性更强、更广。
cre-RMCE
3.3 RMCE举例
目的：通过元件替换方式将细胞颜色荧光标签由绿色改为红色
Case 1
可以看到：loxP66-GFP-loxP71元件在Cre重组酶的帮助下，被替换为loxP66-DsRed-loxP71，由此，细胞的荧光颜色由红色转为绿色。但这个系统的效果看似并不那么好，只有少数细胞表现为红色，而大部分仍然是绿色的，而造成这个结果的原因是什么？欢迎留言给出自己的答案，下周我会将自己的解读放上来。
RMCE-training
4. RMCE目前的使用情况
在TELEN、ZFN和CRISPR-Cas9技术的出现，使得knockin所需的同源臂长度从原来的十几kb，缩小到1 kb以内，大大降低了knockin的难度。然而即使是新技术的出现，knockin仍然具有较大的难度，尤其是knockin的效率会随着插入片段的长度增加而降低，超过3kb的knockin难度大大增加。个人小小整理RMCE使用情况如下：
（1）早期RMCE技术主要和慢病毒、转座子系统结合：使用慢病毒或转座子系统（睡美人SB或piggyBac）将master载体整合到基因组中，构建出master cell line，之后在Cre重组酶的帮助下，将目标序列置换到master line中，从而一步得到新的细胞系。慢病毒和转座子系统有高效的特点，但其机制是随机整合，因此当课题需要精确编辑时，这种整合方式则无法被采用。
（2）使用TELEN、ZFN技术将master载体质粒knockin到细胞中，构建master line，随后的故事同上。这个方案运用了精准敲入，因此难度增加不少，但系统成熟不少。有人可能会说，knockin我不怕难，我可以一个一个的knockin，不需要使用RMCE系统。但需要考虑到同一个细胞系，随着培养时间的增加，细胞系内异质性也会增加。有些课题对基因背景的均匀性有着变态的需求，此时使用RMCE系统置换元件的方式，可以得到几乎一致的基因背景，但knockin序列不同的实验细胞系，从而提供更均匀稳定的实验背景。
（3）敲入短片段master载体，通过Cre将长片段置换到master line中，完美避开长片段敲入极其困难的困境。
（4）对于基因编辑困难的细胞，能获取一个master line，会让整个课题组的工具系统上升一个等级。做过knockin的人都知道这个过程的困难。以TELEN系统为例，需要共转至少3个质粒：含有TELEN同源臂的+目的基因的载体，TELEN导航质粒Left + Right。以干细胞为例，转染效率是1%，那么一百万个细胞可获得约1万个被转染的细胞，而被共转的细胞则可能只有500个，这500个细胞中，真正被纯合knockin的细胞可能只有几个。按照传统挑单克隆的方式，那么很有可能就是培养了100个单克隆细胞系，最后只有1个是真正需要的，这个工作量想起来都让人觉得害怕。不过一般使用药物筛选方式，可最后筛出抗药生长的单克隆团，但分离出单克隆的步骤仍不可少。
RMCE可以提供更为均匀稳定的实验背景，但其优势也限制了其应用，因为master line敲入的位点限制了后续的应用。例如master line敲入位置是AAVS1位点，而其实课题需要的多个knockin是在多个不同位点的。此时RMCE系统则起不到作用。是的，RMCE是基因编辑技术的补充，不能要求其完成一切需求，但有了它，我们能用的工具就更多了。个人觉得，AAVS1 knockin的master line非常实用，可以轻松构建荧光标签细胞系，同时更多的inducible细胞系也更容易获取。单独把RMCE拿出来讲，它可能不够出彩，它只是一个默默的扳手，看起来不起眼，但在关键时刻，还真香。
Reference：
[1] Araki, Kimi, Masatake Araki, and Ken‐ichi Yamamura. "Site‐directed integration of the cre gene mediated by Cre recombinase using a combination of mutant lox sites." Nucleic acids research 30.19 (2002): e103-e103.
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