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慢病毒包装和侵染细胞的过程

慢病毒包装和侵染细胞的过程

作者: 熙氧夕夏 | 来源:发表于2020-08-11 17:14 被阅读0次

    一、慢病毒

    逆转录病毒(Retrovirus):是一种RNA病毒,在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA, 再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。

    慢病毒(Lentivirus):属于逆转录病毒科,名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。

    最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来,而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用,除了HIV病毒系统以外,后续还有猿类免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)载体系统、猫免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus, FIV)载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒(MMV)载体系统和马传染性贫血(EIA)载体系统等。

    慢病毒结构:

    2个调节基因:

    (1)tat基因:反式激活因子,对HIV基因起正调控作用。

    (2)rev基因:病毒蛋白表达调节因子,增加gag和env基因对结构蛋白的表达。

    4个辅助蛋白(附属)基因:

    (1)vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生;

    (2)vpr和nef参与疾病的表现。

    慢病毒的优势:

    1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组,使宿主细胞长时间稳定表达外源基因;

    2.可感染分裂和非分裂细胞;

    3.低免疫原性,直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验;

    4.可以更换特异性启动子;

    5.野生型的HIV大小约为9.8 kb,插入片段可长达5-6 kb;

    二、慢病毒载体

    慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

    慢病毒包装过程:

    慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂。

    慢病毒包装和侵染细胞的过程(元和生物)

    三、慢病毒的使用和优势

    慢病毒的使用量的取决因素:滴度, 感染体积 ,MOI ,细胞密度

    滴度(Titer):单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位:TU/mL (活性滴度单位)、copies/mL (物理滴度单位)

    检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。

    实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。

    MOI(multiplicity of infection):感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到 80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。

    最后,818 一些有关慢病毒方面的产品:

    1.关于慢病毒载体构建方面:

    ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100,ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】

    shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050,shRNA慢病毒】

    miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050,miRNA/inhibitor慢病毒】

    Cas 9 和sgRNA克隆产品【LPP-CP-LvC9NU-载体-100,Cas9 慢病毒】

    2.慢病毒包装服务方面(慢病毒颗粒,病毒浓缩,包装细胞系等)

    LT001,基于HIV骨架的慢病毒颗粒包装试剂 (20 reactions)

    LT005,基于qRT-PCR技术的HIV骨架慢病毒颗粒滴度检测试剂 (20次RT反应 +50次PCR反应)

    LT007,慢病毒浓缩试剂盒(50 ml)

    LT008,293Ta慢病毒颗粒包装细胞系 (1.5 x 106 cells)

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