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PCR-SBT方法是世界卫生组织WHO推崇的HLA 分型的金标准,其实就是指的直接测序,无论是WGS, WES, RNA_seq 数据都可以。近几年来涌现了很多的软件,支持从NGS测序数据直接确定HLA Allel, HLAminer 就是其中之一。
官网如下:
https://github.com/warrenlr/HLAminer
安装过程如下:
wget https://github.com/warrenlr/HLAminer/releases/download/v1.3.1/HLAminer-1.3.1.tar.gz
tar xzvf HLAminer-1.3.1.tar.gz
cd HLAminer-1.3.1/HLAminer_v1.3.1/
下载解压即可,软件目录结构如下:
├── bin
├── database
├── database_bwamem
├── docs
└── test-demo
bin
目录下就是所有的可执行脚本,database
目录下是所有的数据库文件,包含HLA CDS序列,HLA 基因序列,不同HLA Allel共享的蛋白结构域文件,在database
目录下还有对应的bash脚本,可以用于更新数据库。
该软件的架构如下:
HLAminer有两种策略可供选择:基于目的片段组装的HPTASR和基于序列比对的HPRA。 在bin
目录下,封装了一系列的bash脚本,可以简化软件的调用。
1. 基于目的片段组装 HPTASR
基于组装的算法精确度高,但是运行速度是它的劣势,对应的bash脚本前缀为HPTASR
, 包括以下4个脚本
-
HPTASRwgs_classI.sh
-
HPTASRwgs_classI-II.sh
-
HPTASRrnaseq_classI.sh
-
HPTASRrnaseq_classI-II.sh
wgs
代表全基因组数据,rnaseq
代表转录组数据; class I
和class II
分别对应HLA I型和II 型基因,根据测序数据的类型和预测的HLA基因的类型,选择对应的bash脚本就可以了。
这些脚本都会读取一个名为patient.fof
的配置文件,内容示意如下
rd1.fq
rd2.fq
里面保存的是每个样本R1端和R2端fastq文件的路径。这些bash脚本实际是把多个步骤放在一起了,实际运行时可以根据需要进行修改,
HPTASRrnaseq_classI.sh
内容如下
###Run TASR
echo "Running TASR..."
#TASR Default is -k 15 for recruiting reads. You may increase k, as long as k < L/2 where L is the minimum shotgun read length
../bin/TASR -f patient.fof -m 20 -k 20 -s ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -i 1 -b TASRhla -w 1
###Restrict 200nt+ contigs
cat TASRhla.contigs |perl -ne 'if(/size(\d+)/){if($1>=200){$flag=1;print;}else{$flag=0;}}else{print if($flag);}' > TASRhla200.contigs
###Create a [NCBI] blastable database
echo "Formatting blastable database..."
../bin/formatdb -p F -i TASRhla200.contigs
###Align HLA contigs to references
echo "Aligning TASR contigs to HLA references..."
../bin/parseXMLblast.pl -c ncbiBlastConfigO.txt -d ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -i TASRhla200.contigs -o 0 -a 1 > tig_vs_hla-ncbi.coord
###Align HLA references to contigs
echo "Aligning HLA references to TASR contigs (go have a coffee, it may take a while)..."
../bin/parseXMLblast.pl -c ncbiBlastConfigO.txt -i ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -d TASRhla200.contigs -o 0 > hla_vs_tig-ncbi.coord
###Predict HLA alleles
echo "Predicting HLA alleles..."
../bin/HLAminer.pl -b tig_vs_hla-ncbi.coord -r hla_vs_tig-ncbi.coord -c TASRhla200.contigs -h ../database/HLA_ABC_CDS.fasta
输出结果的文件名为HLAminer_HPTASR.csv
,当多个样本同时运行时,由于生成的中间文件名字相同,为了保证顺利并行,必须在不同的文件夹下运行。
2. 基于序列比对 HPRA
基于序列比对的算法,运行速度块,但是精确度较差,对应的bash脚本前缀为HPRA
, 包括以下脚本
-
HPRArnaseq_classI.sh
-
HPRArnaseq_classI_SE.sh
-
HPRArnaseq_classI-II.sh
-
HPRArnaseq_classI-II_SE.sh
-
HPRArnaseq_pacbioSEclassI.sh
-
HPRAwgs_classI.sh
-
HPRAwgs_classI_SE.sh
-
HPRAwgs_classI-II.sh
-
HPRAwgs_classI-II_SE.sh
脚本中不同文字的含义和HPTASR
相同,以HPRArnaseq_classI.sh
为例,分析步骤如下
bwa 比对:
bwa mem -a ../database_bwamem/HLA_ABC_CDS.fasta rd1.fq rd2.fq > TEST_vs_HLA.sam
分型:
perl ../bin/HLAminer.pl -a TEST_vs_HLA.sam -h ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -p ../database/hla_nom_p.txt
输出文件为HLAminer_HPRA.csv
。
两种算法虽然输出文件的名称不同,但是内容是一致的,示例如下
HLA-A Prediction #1 - A*26
A*26:33,3555.00,2.66e-63,625.8
HLA-B Prediction #1 - B*55
B*55:29,2960.00,2.36e-54,536.3
对于每个HLA 基因,会给出对应的分析结果。HLAminer通常能够给出2位或者4位的分型结果。
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