《Chem. Rev.》挤出生物油墨凝胶可印刷性的物化因素

【科研摘要】

生物印刷研究人员一致认为，“可印刷性”是生物墨水发展的关键特征，但该术语的含义或实验测量其的最佳方法都尚未建立。此外，关于确定生物墨水可印刷性的潜在机制知之甚少。对这些机制的透彻了解是新生物墨水有意设计的关键。可印刷性域定义为生物墨水要求，这些要求是生物印刷所特有的，并且发生在印刷过程中。美国威克森林再生医学研究所Sang Jin Lee教授团队在8月《Chemical Reviews》综述了题为‘‘Physical and Chemical Factors Influencing the Printability of Hydrogel-based Extrusion Bioinks’’一文。对可印刷性的不同方面以及影响它们的因素进行了回顾。就生物墨水的流变性，详细研究了其可挤出性，细丝分类，形状保真度和印刷精度。化学结构和印刷参数。讨论了这些关系，并确定了需要进一步研究的领域。这项审查有助于生物墨水的开发过程，该过程将继续在生物打印，组织工程和再生医学的成功与失败中扮演重要角色。

1. 简介

生物工程改造人体各种组织或器官的能力是现代研究和医学领域极力追求的目标。组织工程策略利用细胞，信号分子和生物材料来产生最终的组织样产物。尽管利用这些策略已显示出相当大的成功和随时间的改进，但对个性化，大规模，可植入组织构造的需求不断增加。未来的关键是将要利用的制造工艺。制造过程决定了可使用的材料，可以创建的架构以及最终产品的时间和成本。

增材制造（也称为3D打印）正在导致社会产品的制造方式发生巨大变化。在组织工程策略中也引起了极大的兴趣。解剖结构通常在患者和疾病进展之间异常，复杂且高度可变，相对于更传统的技术（例如机加工和成型），其优势在于增材制造的灵活性。组织工程领域已经采用了许多不同类型的增材制造方法，以与生物材料和细胞配合使用，称为“生物打印”。其中最常见的是基于挤出的生物打印。基于挤出的生物打印可以轻松地合并多种材料类型，如果需要在生物材料，细胞类型或信号分子方面存在任何区域差异，则必须采用这一策略。

为了确保成功进行基于挤压的生物打印，首先是适合通过自动生物制造技术进行处理的细胞配方材料，其中也可能包含生物活性成分和生物材料。这些材料称为生物墨水，必须满足许多困难的要求。首先，它们必须具有生物相容性并且对细胞无毒，并且如果植入后不能促进宿主免疫反应。细胞必须直接悬浮在这种材料中，这既需要足够薄的材料来均匀混合细胞，又需要足够厚的材料来保持这种分布并防止细胞沉降。细胞封装还必须使生物墨水主要由水组成，因此，使用水凝胶。生物墨水必须提供生物活性/细胞附着位点，以允许细胞存活，附着和增殖。它们必须具有适当的机械性能，在驱动细胞行为以及承受处理和植入过程中的机械力方面都最好与组织应用相匹配。适当的溶胀和降解特性也是必要的。营养物质（例如葡萄糖和氧气）必须能够通过材料扩散，以允许细胞在构建体最深处存活。最后，生物墨水还应通过在靶组织的ECM中发现的天然衍生的聚合物，蛋白质和结合位点来指导细胞行为。

这些要求是大多数组织工程应用程序所共有的。对于生物打印过程，生物墨水应满足三个基本要求：相对较高的粘度，以保持细胞悬浮均匀并提供初始结构完整性；强大的剪切稀化行为，以最大程度减少打印过程中受剪切应力驱动的细胞损伤；以及快速交叉打印后的链接过程。

该综述重点关注影响3D生物打印过程特有的基于水凝胶的生物墨水可印刷性的物理和化学因素。特别是，概述了可能影响可印刷性不同方面的潜在机理，并提出了具有动态交联网络（物理相互作用和动态共价键）的新型水凝胶，可用于基于细胞的微挤出生物印刷。

【图文解析】

2. 可印刷性

生物墨水有许多特定于生物印刷过程的要求。这些要求涵盖了生物墨水“可印刷性”的不同方面。从最广泛的意义上讲，可印刷性仅指被印刷的能力。为了进行此审查，将考虑以下定义：“材料在经受特定的一组印刷条件时能够以导致给定应用所需的印刷结果的方式进行印刷。”

生物油墨必须克服的可印刷性的第一方面是从微米级喷嘴尖端挤出。这种能力有时被称为生物墨水的“可挤出性”。如果用太大的力挤出材料，细胞将因剪切应力而永久损坏。此外，由于无法轻易实现更高的流速，因此打印时间将更长。结果，如果生物墨水对挤出力的要求过高，则无法使用。挤出后，还必须以可预测的方式沉积生物墨水。研究人员使用细丝分类系统来描述生物墨水可以形成的细丝的不同类型。在其尖端形成液滴的生物墨水会急剧散布并粘附在自己身上。需要连续的细丝，并且这些细丝可以是均匀的（光滑的）或不均匀的（蓬松的，弯曲的）。生物打印机可以轻松控制平滑的长丝沉积，但是不均匀的长丝可能会偏离打印路径，并在其整个长度上具有可变的横截面。生物墨水沉积后，必须保持所需的形状，因为多层沉积在其顶部。生物墨水的这种“形状保真度”限制了生物墨水能够在结构上完成的最终尺寸和形状。最后，根据应用场合，可能需要不同的印刷条件（喷嘴尺寸，印刷速度等），进一步限制了整个系统。受印刷条件影响，印刷构造与所需尺寸的相似性可以称为“印刷精度”。可印刷性一词已被用来分别描述这些要求。但是，如果在这些区域中的任何一个发生故障，生物墨水都无法进行生物印刷。因此，本综述将把这些因素中的每一个视为可印刷性的奇异方面。

2.1 关于生物墨水开发的思考

在生物墨水受到所有限制和要求的情况下，可用的生物墨水仍然是生物印刷的主要限制也就不足为奇了。研究人员将从当前生物墨水的改进和扩展的生物墨水调色板中受益匪浅。文献中已经提出了许多水凝胶和水凝胶组合。但是，每个领域至少在一个领域，有时甚至在多个领域都有很大的改进空间。造成这一困难的原因是，对生物墨水提出的许多要求直接相反。在许多情况下，在沉积时特别好地保持其形状的生物油墨也需要最大的压力才能挤出。这种折衷可以通过各种策略来部分规避，这些策略包括快速的后印刷交联或胶凝，支持液的使用以及表现出特别高的剪切稀化性的生物墨水。另外，尽管在生物墨水的生物活性和组织特异性潜力方面经常取得长足进步，但这些生物墨水通常并不十分适合生物印刷，反之亦然。例如，Pluronic F127为挤出生物印刷提供了出色的可印刷性，但受到其生物学特性的限制。同时，脱细胞的细胞外基质（dECM）由于具有高的组织特异性生物活性而被转换为生物墨水，但形成了非常弱的凝胶，当进行生物打印时无法自行保持其形状，必须通过补充策略来弥补。

生物墨水的发展是一个不断发展的领域，其主要目标是克服这些种种限制。关于可印刷性，生物墨水的发展本身受其对影响可印刷性的潜在机制的理解的限制。影响可印刷性的因素众多，复杂且相互关联。已经确定了印刷条件，材料特性和可印刷性之间的许多关系。然而，这些发现中有许多是模棱两可甚至矛盾的，还有更多的关系尚未研究。在生物墨水开发过程中，此知识用于设计，优化和改进生物墨水。在缺乏的地方，研究人员必须使用反复试验来进行工作，并使用不太理想的结果向前迈进。这篇综述的目的是研究这些各种关系，以期增进对可印刷性及其影响因素的更好的理解和更全面的认识，进而改善生物墨水的开发过程，从而改善可印刷性。

2.2 适印性指标

为了调查影响可印刷性的因素，需要对用于量化可印刷性的措施有清楚的了解。本节将简要介绍该主题。并非所有针对生物墨水的要求（非特定于印刷过程的要求）都应考虑在可印刷性范围内。考虑了可挤出性，长丝类型，形状保真度和印刷精度的不同度量。

可挤出性只是指生物墨水可以通过小直径喷嘴挤出的容易程度，从而影响总处理时间和细胞活力（图1A）。生物打印过程中的细胞活力与注射器中细胞所经历的压力，喷嘴中细胞所经历的剪切应力以及细胞在注射器中所花费的时间有关，因此研究人员有时会间接量化在生物打印过程之后立即通过活/死分析测定其系统的可挤出性。其他人使用挤出压力作为可挤出性的量度。这既可以是达到指定流速所需的压力，无论给定压力是否能够实现流量，或者可以是导致系统中流量的最小压力。关于生物墨水可挤出性的更复杂的度量涉及流变学度量，例如剪切速率-粘度关系和幂律常数，将在后面的部分中进行介绍。

图1. 不同方面可印刷性。

细丝类型可以很容易地定性确定。几位研究人员通过将生物油墨挤出到空气中而不是在基材上进行测试，并将挤出材料的形状分为液滴或细丝（图1B）。形成细丝的生物油墨可以通过细丝是光滑的还是细丝来进一步分类。正如其他一些研究人员所观察到的，沉积后不均匀的细丝可以更容易地被识别。但是，灯丝类型最有效的度量是定量的。沉积之后，可以由长丝制成各种尺寸，包括相对于理想正方形的方孔的周长，相对于直线的单根长丝的周长以及长丝宽度的可变性。生物墨水的形状保真度通常以单根细丝的宽度和/或高度来衡量（图1C）。尽管易于评估，但该措施极易受到沉积的材料数量以及与表面基材相互作用的影响。已经以多种方式测量了打印精度。其中一些措施与形状保真度的措施非常相似（图1D）。关键区别在于，打印精度测量结果将比较不同打印条件下的常见生物墨水，而形状保真度测量结果将比较常见打印条件下的不同生物墨水。

3. 印刷结果与流变性质之间的关系

流变学是研究物质流的物理学分支。它已被证明对生物墨水的开发非常有用，并且有几种流变学测试可应用于生物印刷。大多数水凝胶表现出非牛顿行为。在牛顿流体中，剪切速率与剪切应变之间的关系是线性的，粘度在各个应变速率之间保持恒定。另一方面，水凝胶通常具有剪切稀化作用，这意味着它们的粘度会随着剪切速率的增加而降低，从而有利于流动。随着剪切速率的增加，材料的表观粘度降低，从而与其他情况相比，在材料（重要的是孔）上具有较低的压差和较低的剪切应力的情况下发生流动。这种特性通常通过扫频来测量，其中材料在一定频率或剪切速率范围内以恒定应变进行测试（图2A）。同样重要的是材料的触变性。一旦施加应变速率，触变材料将随时间显示表观粘度降低。粘度的这种变化反过来会影响生物墨水随时间的流动。触变性有时会与剪切稀化相混淆，因为这两种性质都会导致粘度降低，但剪切稀化会随着应变速率的增加而发生，而触变性会在给定应变速率下随时间而发生。材料也可以是剪切增稠的（剪切稀化的对面）和流变色的（触变质的对面），但是这些对于生物印刷是非常不希望的。

图2.与生物墨水可印刷性相关的常见流变学指标。

水凝胶材料还表现出粘弹性，这意味着它们的行为由粘性和弹性成分共同决定。弹性成分由储能模量（用G'表示）测量，是指在施加变形时存储在材料中的能量。粘性成分被测量为损耗模量，表示为G''，并且是指在对材料施加变形时损失的能量。损耗角正切或tanδ是损耗模量（G''）与储能模量（G'）之比。tanδ表示粘性和弹性成分对材料的相对贡献，值小于1的材料具有较高的弹性贡献，值大于1的材料具有较高的粘性贡献。通常，这些特性是通过应变或应力扫描在线性粘弹性区域（LVR）中测量的。频率保持恒定，应力或应变增加，整个LVR的储能模量，损耗模量和tanδ均保持相对恒定（图2B）。最后，流变学已用于测量水凝胶从挤出中恢复的能力。恢复测试分三个步骤进行。起初，将非常低的剪切速率应用于材料，以模拟预挤出条件。随后是旨在模拟挤出的高剪切速率。再接着，将材料恢复到初始剪切速率，以模拟挤出后的条件（图2C）。

4. 打印结果与工艺参数之间的关系

某些可印刷性度量会受到印刷过程的影响。这些可印刷性的度量包括：线宽，角分辨率，角规则性，孔尺寸和长丝水平保持力。通过改变过程参数集来控制可印刷性的度量。这些可印刷性的度量已通过视觉进行了定性或定量评估。通过肉眼和判断进行了定性评估。定量评估包括照相机或显微镜拍摄的照片，然后使用诸如ImageJ的软件进行图像分析。

4.2 通过工艺参数改善可印刷性

受工艺参数影响的主要研究可印刷性措施包括线宽和线高（图4）。这种区别来自报告文献中仅定量的评估；定性评估未包括在图4中。但是，对这些发现进行了定性总结，因为诸如不同材料之类的因素造成了结果的显着差异。不管材料特性在不同的挤出印刷系统中发挥的作用如何，趋势都是普遍的。

图4.可印刷性度量与工艺参数之间的关系，以控制线宽和线高（横截面几何形状）。

5. 物理相互作用

通常通过通过物理相互作用或化学键形成的交联网络来制造水凝胶。物理交联的水凝胶的特征在于网络与弱的非共价相互作用紧密相连，包括氢键，疏水相互作用，离子相互作用，主体-客体相互作用，金属-配体相互作用和π-π堆积相互作用。这些可逆的相互作用使大多数物理水凝胶由于动态流变特性而具有良好的可印刷性，这对于基于微挤压的印刷工艺非常有利。在本节中，着重于（i）氢键作用，（ii）主体与客体之间的相互作用以及（iii）金属与配体之间的配位，这些化合物由于其多功能性而在最近出现的剪切稀化和自修复水凝胶中主要使用以及化学方面的灵活性，从而可以采用多种新的设计方法。对于其他类别的物理相互作用（如离子，疏水和π-π相互作用）的详细讨论，请读者参考各种近期的出色评论，这些评论描述了剪切稀化和/或自愈物理水凝胶形成的设计策略。

5.1 氢键

氢键是非共价动态相互作用，其中连接到负电性原子（例如氧，氮和氟）的氢原子与其他邻位负电性原子形成部分分子间键合相互作用。

5.1.1 基于酚类化合物的相互作用

Shin等。报道了在存在富含没食子醇的交联剂寡表没食子儿茶素没食子酸酯（OEGCG）的情况下，与没食子酸酯结合的透明质酸（HA-Ga）的快速自发凝胶化的现象（图5A）。水凝胶形成的主要驱动力是多重的胆甾醇与胆甾醇和氢氧根之间的氢键相互作用（图5B）。流变学研究表明，储能模量（G'）和损耗模量（G''）取决于[d-葡萄糖醛酸-d-N-乙酰氨基葡萄糖]/[胆甾醇（OECGG）]的化学计量比。比率为2时，在1 Hz时G'值为341.6±53.6 Pa，而比率为0.5时，水凝胶显示G'值为1390.5±128.0 Pa。涉及加洛尔的交联是可逆的，因此这种水凝胶表现出剪切稀化行为（图5C）。在交替应变下，G'和G''恢复到其初始值的92％和80％（图5D），并且G'和G''在540 s的分数后几乎恢复到其初始值（红色箭头）。该水凝胶能够用26 G针头注射（图5E）。

图5.（A）制备HA-Ga/OEGCG的富含胆醇，剪切稀化的水凝胶的示意图。（B）建议的在加洛尔-加洛尔部分和加洛尔-HA骨架之间形成多个氢键（红色虚线）。（C）粘度随剪切速率变化的HA-Ga/OEGCG水凝胶的比例[HA单位]/[Gallol in OEGCG]为7（蓝色），2（黑色）或0.5（红色）。（D）在从0.1％至10％回落至0.1％的交替应变下显示水凝胶结构的G′的回收率测量。（E）使用26 G针显示HA-Ga/OEGCG水凝胶的可注射性（比例= 0.5）的照片。（F）3D打印的示意图，其中胆甾醇ECM水凝胶墨水从剪切变稀的水凝胶过渡在印刷过程中，通过印刷后的氧化作用使其具有机械稳定性。（G）具有各种浓度（4、6wt％）的没食子醇ECM油墨的可印刷性和作为凝胶形成后的时间（0.5、1、2h）的函数的可注射性。

5.1.2 尿嘧啶嘧啶酮自互补二聚

自互补四重氢键相互作用可用于开发动态超分子水凝胶。Zhang等人使用可逆的加成-断裂链转移（RAFT）聚合路线。合成了一种水溶性ABA三嵌段共聚物（称为UNONU），该共聚物由中间的聚（环氧乙烷）嵌段（A）和末端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAm）嵌段与Upy部分组成（图6A）。PNIPAM核心域中的UPy部分牢固地保持了聚合物链，从而形成了水凝胶交联的3D网络（图6B）。UNONU共聚物显示出温度响应的溶胶-凝胶转变，而没有掺入UPy的共聚物（NON）即使在37°C时也不会形成凝胶（图6C）。该观察清楚地支持了UPy自我互补二聚作用在水凝胶形成中的关键作用。机械破坏后，UNONU共聚物水凝胶显示出快速的自愈特性（图6D）。流变学研究表明，G'在整个频率范围内均占主导地位（图6E），超分子水凝胶柔软但具有高弹性（tanδ<0.2）。水凝胶的粘度随着剪切速率的增加而降低，表明水凝胶可以通过挤出过程注入（图6f）。当两个单独的水凝胶碎片接触时，观察到快速愈合。此外，粘附的界面可以承受拉伸（图6g，h）。< span="">

图6.（A）ABA三嵌段共聚物的化学结构。（B）在温度转换下制备的水凝胶的可逆溶胶-凝胶转变的示意图。（C）通过简单的倾斜在低温（4°C）和温暖（37°C）条件下对UNONU和NON聚合物溶液进行胶凝测试。（D）在37°C下水凝胶的动态应变振幅循环试验（γ= 0.5％和200％），显示出快速的自愈特性。（E）水凝胶的频率依赖性（在1％应变下）振荡剪切流变学。（F）水凝胶的粘度测量（插图：在室温下水凝胶的注射测试）。（G）用剃须刀将水凝胶切成相等的两半。（H）自愈水凝胶也可以承受拉伸。

5.2 主体-客体互动

大环化合物的两大类是环糊精（CDs）和cucurbit[n]urils (CB[n]s)，它们是为与多种客体化合物络合提供空腔空间的主体。这些基于主体化合物的超分子相互作用已得到利用 生产各种动态水凝胶。

Xu等开发了一种通过β-CD-金刚烷（Ad）主体-客体相互作用形成的自组装导电水凝胶。通过3,4-乙撑二氧噻吩的氧化聚合反应合成导电聚合物（PEDOT：S-Alg-Ad）（EDOT）在金刚烷基改性的硫酸化藻酸盐（S-Alg-Ad）存在下（图7A）。PEDOT：S-Alg-Ad聚合物通过S-Alg-Ad中的金刚烷部分与聚β-环糊精（Pβ-CD）中的CD之间的主客体识别形成水凝胶（图7B）。在流变学检查中，水凝胶的粘度随剪切速率的增加而降低，表明它们表现出剪切稀化行为（图7C），可以通过水凝胶组成对其进行调节。这种特性使这种水凝胶可以轻松地包裹细胞，并可以注射形成3D构建体。而且，当去除所施加的应变时，该水凝胶可以通过多个循环（G'> G''）快速回收（图7D）。该水凝胶表现出优异的自修复性能。当两个分开的水凝胶块紧密接触时，间隙迅速消失，在60 s内经历了完全的自愈（图7E）。

图7.（A）PEDOT：S-Alg-Ad聚合物的合成方案。（B）利用客客复合物形成动态交联的示意图。（C）连续流动实验，显示了不同主体-客体导电水凝胶的剪切应力（实心符号）和粘度（空心符号）。（D）当交替阶跃应变从1％切换到500％时，导电水凝胶的自愈特性。（E）PEDOT：S-Alg-Ad（2：1）/Pβ-CD水凝胶的自愈过程的明场图像。

5.3 金属-配体配合

有机配体与金属离子之间的配位相互作用已被广泛用作可逆交联键，以生成动态的超分子水凝胶。迄今为止，各种各样的金属-配体对已经产生了具有变化的流变学和机械性能的各种水凝胶。在本节中，重点介绍基于几种金属螯合交联方法的动态水凝胶的最新设计策略，其中感兴趣的有机螯合配体包括双膦酸酯（BP），羧酸酯，邻苯二酚和组氨酸。

具有两个与中央碳原子共价连接的膦酸酯基团（PO（OH）2）的BPs用作有机配体，对各种多价金属阳离子（例如钙（Ca2+）和镁离子（Mg2+））表现出出色的结合亲和力 。最近，研究人员报道了一系列基于HA的超分子水凝胶，这些水凝胶也被原位形成的NP稳定，并通过BP配体与各种二价金属离子（M）之间的相互作用组装而成。自组装的HA-BP -M水凝胶是通过在水性条件下将HA-BP，游离BP和各种金属离子简单混合而形成的（图9A–D）。各种碱土金属（AEM）或过渡金属（TM）的二价阳离子与多个BP配体配位以形成BP-M NP交联，以建立动态水凝胶网络。有趣的是，G'和G''值取决于NP交联的直径（图9E，F）。随着BP-M NPs尺寸的增加，水凝胶的模量从Mg2 +系统降低到Ba2 +系统。对于基于TM的NP，与最小NP交叉交叉的HA-BP-Co水凝胶显示最大的G'和G''值。对于HA-BP-M水凝胶，在高剪切应变下，G'急剧下降至低于G''的水平，表明水凝胶的剪切变稀行为。使用振荡应变实验也观察到了极好的恢复能力（图9G）。这项工作为控制金属-配体配位水凝胶的动力学提供了有用的策略。考虑到它们作为生物墨水的可印刷性，可以根据金属离子的种类轻松优化这些水凝胶的流变和机械性能。

图9.（A）双膦酸酯改性的透明质酸（HA-BP）的示意图和分子结构。（B）通过BP-M配位，围绕HA-BP大分子单体的接枝BP基团的BP-M NP的有效原位自组装。（C）水凝胶网络由BP-M NP稳定。（D）用于水凝胶制造的代表性元素（AEM和TM）和相应的二价阳离子的直径。（E，F）分别用一系列AEM离子和TM离子制备的纳米复合水凝胶的代表性振荡流变分析结果。所有水凝胶均以相同浓度的离子，游离BP和HA-BP制备。（G）在交替的高（20％）和低剪切（0.1％）下的HA-BP-M纳米复合水凝胶的流变数据。

6. 动态共价键

尽管物理上可交联的水凝胶在微挤压生物打印方面具有许多优势，但基于水凝胶的打印结构的机械稳定性通常很低，并且这种弱的抗变形性通常需要后处理才能稳定3D组织结构。相反，用永久性共价键交联的化学水凝胶在机械上更牢固，但是一旦形成交联，网络就不可逆转。化学网络的这种非动态特性限制了它们作为3D生物打印生物墨水的应用。通过化学凝胶化的3D组织构建体的当前制造方法通常是基于混合溶液的挤出，该混合溶液包含双组分互补反应性聚合物或光/温度介导的可聚合化合物。由于化学网络是在挤出混合状态下形成的，因此必须考虑影响凝胶行为的各种因素，包括混合溶液的均匀性以及混合速度，这一点至关重要。过快的交联会导致喷嘴凝结，而过晚的交联会导致挤出后扩散，因此无法生成自立的3D结构。

因此，动态共价键在新型水凝胶的产生中引起了极大的关注。动态共价键是特殊的化学键，在键合状态和离解状态之间处于恒定的平衡状态。值得注意的是，这些键结合了化学键的强度和物理相互作用的可逆特性，可以显示出动态的流变行为。通过动态共价键形成网络的化学物质包括亚胺，，肟，二硫键和硼酸酯键的形成，以及Diels–Alder环加成反应。与这些具有永久性共价交联键的动态凝胶交联的水凝胶在载有细胞的3D构建体方面比具有永久性共价交联键的凝胶具有优势，因为这些键的动态重排使细胞易于移动并扩散到水凝胶结构中。

为了针对动态水凝胶的新设计方法，已经提出了基于超分子组装，大分子化学，掺有胶体纳米颗粒的复合方法等多种化学策略。大量研究提供了有关决定动态水凝胶流变性的结构-性质关系的大量信息。因此，设计方法的多样性可以提供对具有可调流变特性的理想生物墨水的新见解。此外，新开发的设计策略可能会打破常规水凝胶的有限范围，并可能为3D生物打印应用的理想生物墨水设计铺平道路。在这篇综述中，专注于在生理pH和温度下展现其固有特性的动态水凝胶。因此，本节不讨论其交换反应被外部刺激（例如pH或UV光）激活的基于动态共价键的动态水凝胶。这些动态共价键的实例包括苯硼酸酯-水杨基异羟肟酸酯键，苯硼酸酯-邻苯二酚键和三硫代碳酸酯单元的改组反应。

6.1 亚胺键

席夫碱的形成通常通过伯胺和醛之间的反应在温和的生理条件下产生亚胺键而发生。

6.2 腙键

已知亚胺键易于水解，这在维持水凝胶的体内结构和机械稳定性方面可被认为是弱点。腙键与亚胺键紧密相关，是由醛和酰肼之间的反应形成的，与亚胺相比，展示了水解稳定性更高。腙形成是基于“点击反应”，并且已经被广泛追求以形成具有动态交联网络的各种水凝胶。

图14.（A）双交联的HA-az-F127水凝胶。（B）在4–60°C的温度范围内，以1 Hz的频率进行温度扫描测试的水凝胶）。（C）粘度与剪切速率的关系。（D）在1 Hz下从连续阶跃应变测量（1％→300％→1％）得到的Gel3的G'和G''。（E）自我修复过程的照片。

Li等报道了由酰肼改性的HA（HAAD）和苯甲醛官能化的F127三嵌段共聚物（BAF127）胶束之间的反应形成的动态水凝胶（HA-az-F127水凝胶）。BAD127共聚物经过热响应自组装形成核-壳型胶束，其表面苯甲醛基团可与HA主链中的酰肼部分反应形成动态酰基键（图14A）。BAF127的胶束化是提高HA-az-F127水凝胶机械强度的关键因素，因为缺乏胶束形成能力的HA-az-TPEG（具有苯甲醛末端的四臂PEG）显示出较低的强度（图14B）。BAF127的胶束化作用导致可注射的动态水凝胶表现出剪切稀化特性（图14C），并且振荡应变变化表明Gel3表现出快速恢复和出色的自愈特性。这反映出动态的酰基酰腙共价键在水凝胶基质中的去偶联和再偶联状态之间动态地进行切换（图14D）。当将水凝胶的两个单独的半圆盘（分别用若丹明B和亚甲基蓝染色）接触时，它们结合成一张水凝胶，在拉伸力下具有良好的延伸性，并且在去除菌株后显示出优异的恢复至原始尺寸的能力（图14E）。

7. 纳米复合水凝胶

另一类重点关注的是纳米复合水凝胶，其通过将纳米材料掺入聚合物材料中制成。这种使用纳米材料的混合策略在生产具有多种功能的多功能水凝胶方面具有创新性。最新研究表明，这些纳米复合水凝胶大多数都具有剪切稀化流变特性，这种流变特性的主要调节剂涉及纳米材料表面与水凝胶之间各种物理键的动态相互作用。近来，以未改性或改性状态使用各种纳米材料，包括钙碳纳米管（CNT），氧化石墨烯（GO）纳米片，碳酸钙，Laponite锂皂石，二氧化硅纳米颗粒以及金和银纳米颗粒。这些纳米材料与天然或经过功能改性的聚合物的合理组合，也可为3D可打印水凝胶生物油墨的化学种类组合提供多种选择的深刻理解。在此，就最新水凝胶系统在3D生物打印中的适用性进行了严格的审查。尽管还研究了一些聚合物纳米颗粒的表面化学，包括聚合物胶乳和胶束以及纤维素纳米晶体，以形成纳米复合水凝胶，但由于其方便性和多样性，大多数化学策略都集中在无机纳米材料的表面。开发具有剪切稀化和自我修复特性的纳米复合水凝胶。在本节中，作者将详细讨论可用于3D生物打印的可打印生物墨水的新颖设计中可利用的无机纳米材料的作用。

7.1.2 石墨烯基纳米材料

与CNT一样，已引入氧化石墨烯（GO）来改善用于3D生物打印的基于水凝胶的生物油墨的机械和流变性能。Liu等报道了基于藻酸盐和GO纳米片的3D可印刷且机械坚固的水凝胶的制造。他们专注于藻酸盐官能化的GO（A-aGO）在调节A-aGO/SA水凝胶的机械和流变性质中的关键作用。对于A-aGO的合成，首先使用Bucherer反应将分散在含藻酸盐的水中的GO胺化，该反应会将GO上的酚氧部分转化为伯胺（-NH2）。胺化的aGO通过静电和氢键作用与阴离子藻酸盐形成A-aGO（图19A–C）。通过向A-aGO/SA溶液中添加Ca2 +离子来制造A-aGO/SA物理水凝胶。A-aGO作为共交联物种发挥了作用，以提供分层开发的水凝胶结构。流变学研究表明，A-aGO0.2/SACa-6（下标表示基于SA的A-aGO和CaCl2的重量百分比）水凝胶显示了0.01至500 s–1的剪切稀化特性（图19D））。发现在固定剪切速率下，A-aGO0.2/SACa-6水凝胶的黏度高于对照组GO0.2/SACa-6和SACa-6水凝胶。该结果反映了A-aGO的明显增强作用。此外，A-aGO0.2/SACa-6水凝胶对振荡应变更敏感。当应变增加到3％时，G'值迅速下降，并在23.5％处与G''相交（图19E）。该发现表明SA链从A-aGO表面可逆地动态吸收和解吸将赋予水凝胶剪切稀化和优异的自愈特性（凝胶结构的快速恢复）。在交替的振动应变下，G'和G''恢复到其初始值的92％和80％（图19F），显示出从凝胶到准液态转变的可逆性比SACa-6水凝胶好得多。为了评估生物打印的能力，可以在丙烯酰胺（AAm）和N，N'-亚甲基双（丙烯酰胺）（MBA），丙烯酰胺（AAm）和丙烯酰胺（AAm）的存在下，使用紫外线介导的聚合作用进一步化学交联A-aGO/SA水凝胶。交联剂。将A-aGO/SA/PAAm纳米复合水凝胶制成各种3D结构。由于A-aGO/SA水凝胶具有适合3D打印的剪切稀化和自修复特性，因此具有良好的适印性，因此最终的UV处理结构具有出色的结构分辨率和良好的机械稳定性。例如，可以印刷A-aGO0.2/SACa-6/PAAm水凝胶以构建具有自重支撑能力的中空五边形结构（图19G）。相比之下，由SACa-6/AAm和GO0.2/SACa-6/AAm水凝胶构成的相同结构显示出低的自立能力并迅速塌陷（图19H，I）。从生物打印的角度来看，这项工作的主要思想是在水凝胶形成之前，在藻酸盐存在的情况下使用胺化GO的方法。使用这种化学方法，藻酸盐通过非共价相互作用被有效地原位吸附在GO纳米片的表面上。这防止了A-aGO的团聚，从而在水中提供了优异的胶体稳定性，反映出A-aGO可以分散在水相中的各个纳米水平上。因此，单独分散的A-aGO可以通过藻酸盐和A-aGO之间的交联相互作用建立强大的凝聚力。A-aGO可以作为有效的纳米交联剂形成水凝胶，并作为A-aGO/SA凝胶可印刷性的关键调节因子。流变性质支持了A-aGO/SA在控制具有明确定义的尺寸和形态的结构的可印刷性方面的重要性。考虑到化学性质，如果可以控制GO纳米片的胺化程度，则可以更容易地调节确定水凝胶可印刷性的流变学和机械性能。

图19.（A–C）制备A-aGO/SA/PAAm纳米复合水凝胶的示意图。（D）表观粘度与A-aGO0.2/SACa-6和SACa-6水凝胶以及不含Ca2 +离子的SA溶液的剪切速率的关系。（E）对于A-aGO0.2/SACa-6和SACa-6水凝胶以及不含Ca2+离子的SA溶液，在1 Hz角频率下，储能模量G'和损耗模量G''作为振动应变的函数。（F）对于A-aGO0.2/SACa-6水凝胶，在2％和300％的交替振动应变和1Hz的角频率下，G'和G''随时间的变化，其中红色数字代表平均值振动应变为2％时的模量。（G）从A-aGO0.2/SACa-6/AAm水凝胶生物油墨（15层）印刷的空心五边形，从顶部和侧面观察。从（H）SACa-6/AAm水凝胶和（I）GO0.2/SACa-6/AAm水凝胶墨水分别进行3D打印的空心五边形图案。

【陈述总结】

水凝胶实现期望的印刷结果的能力，称为其可印刷性，一直是该领域的高度关注。研究人员可以使用许多工具来改善其生物墨水的可印刷性，包括改变化学性质，水凝胶组成，流变特性和印刷参数。生物墨水设计中最具挑战性的方面之一是这些因素之间的相互关系。成分和化学性质会影响水凝胶对外力（流变性质）的响应以及可能适合使用的可操作印刷条件的范围。如果没有使用正确的印刷条件，即使是最佳的水凝胶也会导致不良的印刷结果。同时，尽管许多研究已经着眼于化学修饰如何影响不同水凝胶的流变性，但对可印刷性的转换并不总是直接的。已经确定从可印刷性的角度来看，期望剪切稀化，屈服和快速恢复/自修复行为。但是，某些水凝胶可能表现出这些特性，但仍不足以实现所需的印刷效果。需要进一步的研究来改善这些关系的可预测性，并在生物墨水开发过程中进行更多的有意设计。

作为生物油墨的当前水凝胶在印刷之前和/或之后采用化学交联，不仅调节可印刷性而且稳定最终印刷的构造。然而，存在一些缺点，包括这些水凝胶的有限的流变性和多样性。因此，对新设计的水凝胶的需求迅速增长，该水凝胶可以调节流变学和机械性能以获得所需的可印刷性。在这篇综述中，提出了发展中的设计策略，以控制各种动态水凝胶的流变和机械性能。这些水凝胶是通过不同的化学设计形成的，以基于物理键或动态共价键建立可逆的交联网络。这些键的合理选择或组合是确定所得水凝胶的胶凝动力学以及动态和/或机械行为的最重要因素。通过对近期表现出剪切稀化和自我修复特性的动态水凝胶的全面回顾，收集了许多有关化学设计的有用信息，这些信息可能会建立通用标准，在开发具有理想特性的最佳生物油墨时应将其考虑在内可印刷性。通过各种设计方法，已经提出了许多想法来识别影响微挤压生物印刷用水基生物油墨的可印刷性的主要控制参数。对于基于物理相互作用的水凝胶，不仅可以通过选择适当种类的互补对进行物理相互作用来调节流变学和机械性能，而且可以通过调整每种互补物质在物理相互作用中的浓度和组成比来对其进行调节。对于具有动态共价交联的水凝胶，水凝胶的特性还可以通过几个因素进行调节，包括反应类别，反应溶液的pH值，反应物浓度以及反应物之间的比例。类似地，还可以通过考虑针对基于物理和动态共价键的水凝胶描述的参数，在动力学和力学方面控制基于纳米复合材料的超分子水凝胶。另外，纳米颗粒类别是确定相应的纳米复合水凝胶的物理性质的另一个关键参数。这些各种控制参数通过调节水相或纳米颗粒表面上的分子相互作用，反应动力学以及水凝胶基质中的交联密度来影响所得水凝胶的最终特性。通过这些各种控制参数的巧妙组合，可以开发出具有定制的流变和机械性能的新型动态水凝胶，以用作针对特定3D结构优化的生物墨水。

对于生物墨水的未来发展，基于化学的方法可能会提供重要线索，因为在凝胶动力学，流变和机械性能方面，设计策略对水凝胶性能的影响超过其他因素。尽管最近的化学方法已经显示出开发符合3D生物打印要求的有用的水凝胶生物墨水的希望，但是从化学角度出发，应该做出持续的努力以改善可被人类使用的水凝胶的性能。除了新的化学策略外，将多个键结合在一个系统中的系统设计对于有效控制或改善水凝胶的可印刷性至关重要。使用这种方法，人们可能期望多重相互作用的协同作用增强机械强度，并在挤出后引起快速恢复，这是使用单类动态键无法实现的。可以认为在不同种类的物理键之间，在物理键和动态共价键之间或在不同种类的动态共价键之间，交联网络的键的几种组合是可能的。作为一个例子，作者讨论了通过冷冻凝胶化过程形成氢键诱导的交联，肟基动态共价键基水凝胶的增强作用。目前，已经报道了多种相互作用的多种组合，并且这种设计方法还将成为控制各种动态水凝胶可印刷性的主流策略之一。

对于基于纳米复合材料的动态水凝胶，系统设计需要考虑许多因素。添加剂的选择可以扩展到以前从未考虑过的其他纳米颗粒。尽管本综述中介绍的纳米颗粒类别是基于它们的频繁使用而包括的，但是可以考虑使用多种多样的聚合物，无机（金属和金属氧化物）以及有机-无机纳米材料的各种表面作为生产动态水凝胶的新化学方法。纳米颗粒的形状（球形，棒状，立方或片状）和结构（无孔的固体，多孔或中空）及其比表面积也应考虑在内，以开发出新型的动态纳米复合水凝胶。当前使用的纳米粒子几乎全部基于非弹性的无机硬球，而不管其原子组成和结构如何。然而，柔软且柔性的纳米结构，例如纳米乳剂，纳米气泡和纳米凝胶，已引起人们的关注。这些可变形的纳米颗粒在设计动态水凝胶时可能会提供一些前所未有的见解，因为它们可能会在涉及剪切应力的挤压过程中显着影响水凝胶的流变性。从材料的角度出发，除了基础研究之外，还应该对纳米粒子变形对水凝胶整体动力学的影响进行系统的模拟研究。如上所述，纳米粒子表面的表面化学也可以包括物理相互作用和动态共价键的多种组合。多种类型键的合理组合可以使水凝胶的可印刷性达到生产特定3D构建体所需的水平。

通过关注以上提出的各种建议，确信继续努力将为生物墨水的下一阶段开发带来广阔前景，从而可以更好，更准确地控制最佳的流变学和机械性能。最后，通过各种化学策略建立的先进设计标准无疑将为具有实际临床应用价值的生物墨水的未来发展做出贡献。

【导师简介】

Sang Jin Lee是终身任职的副教授，并被弗吉尼亚理工大学-维克森林大学生物医学工程学院交叉任命。Lee教授获得博士学位他于2003年在韩国汉城的汉阳大学获得化学工程博士学位，并在哈佛医学院和波士顿儿童医院以及维克森林再生医学研究所（WFIRM）的组织工程和细胞治疗实验室获得了博士后奖学金。目前是一名教师。他撰写了140多个科学出版物和评论，编辑了两本教科书，并在几本书中撰写了35章。他目前的研究工作集中在：设计组织工程支架系统（皮肤，骨骼，软骨，骨骼肌，腱/韧带，血管，心脏和肾脏），用于生物工程复合体的3D集成组织器官打印（ITOP）系统，复合组织和实体器官，生物墨水的开发和可印刷性，生物材料与细胞/组织之间的生物粘附和生物整合，药物/蛋白质递送系统，生物缀合和聚合物合成，用于预处理的生物反应器系统，体外微生理系统以及基于NIR荧光的监测系统。

参考文献：

doi.org/10.1021/acs.chemrev.0c00015

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