人体所有组织器官的细胞都是由多能干细胞或原始的细胞分化而成的，在胚胎发育的早期，细胞根据生长发育的需要，分化为各个组织器官的特定细胞，这些细胞分化的轨迹及在组织中趋向于特定空间位置对于组织器官的正常发育至关重要，单细胞转录组和空间转录组技术的出现对于发育生物学方面的研究提供了有力的工具。2021年1月，Cell在线发表了利用这两种技术联合的方法在时间和空间两个维度对人类肠道发育机制的详细研究。
单细胞分辨率下人类肠道发育的时空分析
Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
研究背景
肠道是人体最大的屏障器官，可与肠道菌群共生，协调营养需求和免疫。多种相互关联的细胞类型构成了成熟的肠道及其独特的形态，但是它们形成的分子基础仍然不清楚。在该研究中，利用单细胞转录组测序和空间转录组测序技术绘制了人类肠道发育的大规模单细胞时空形态发生图谱，并提供了肠道发育相关的在线资源，对细胞多样性，细胞间信号传导和转录调控网络进行了分类，对深入探究肠道发育的分子机制奠定了重要的基础。
研究思路
图1 研究思路
研究结论
① 在发育时间和空间上对101种肠细胞类型进行分类
聚类分析分为9个肠腔，并根据转录标注注释上皮、成纤维细胞、内皮（EC）、周细胞、神经（ENS）、肌层、间皮、肌成纤维细胞和免疫细胞（图2a），并发现具有明显的位置和发育时程差异（图2b），并根据关键的marker基因，进行精细的细胞注释，共发现了101个细胞类型, 并绘制了所有101种细胞类型之间的相互作用图，确定了两两细胞群体之间假定的受体-配体(RL)相互作用（图2c）。
图2 基于时间和空间的细胞分群及细胞受体配体预测
② 单个细胞的空间位置
空间转录组通过转录特征分析确定了每个切片中5-13个细胞群，并通过因子分析研究每个spot可能的细胞组成，从而在空间层面上定位单细胞数据（图3a）, 同时使用GEO数据库中成年的scRNA-seq上皮、基质和免疫数据预测了成年和胎儿ST切片的空间细胞类型分布，结果表明特定细胞类型的转录特征也和基于解剖学的位置信息相对应（图3b）。成对细胞类型信号相关性分析强调了几种细胞类型的显著同点共现，与预期的原位细胞定位一致（图3c）。大多数ST spot cluster分布在分层的环状结构中，反映了转录/细胞空间变异性的最大决定因素与组织深度相对应。研究者确定了2,893个与深度相关的基因，反映了在不同层中活跃的途径-较深的spot富集了肌肉/神经过程逐渐向吸收性腔功能发展（图3d）。这与细胞类型特征的顺序富集一致。
图3 不同细胞类型空间位置定位、细胞类型信号相关性分析及空间深度相关基因功能富集
③ 人肠上皮的发育
单细胞测序捕获了17,622个上皮细胞，这些上皮细胞通过marker基因易于区分吸收性、分泌性、未分化、以及干细胞等，研究观察到由高特异性基因表达（图4a）划定的近端（小肠[SI]）和远端（结肠）样品之间的位置差异很大，并通过轨迹分析和多个TF模块进行了确认（图4b）、突显了在隐窝形成之前在发育中建立了位置特异性转录程序。
随着时间的推移，观察到上皮细胞的实质性细胞重塑，在祖细胞/TA细胞占主导的12 PCW之前，几乎没有成熟的吸收性和分泌性细胞，而在12 PCW之后，上皮的成分已经与成年组织相似（图4c）。
图4 细胞类型位置分布差异、轨迹分析和RNA速率分析验证、不同时期细胞统计
④ 肠干细胞的起源和发育
在早期发育中（<12 PCW），研究发现了近端上皮干样祖细胞群，该细胞群发育为早期肠上皮细胞。这些细胞表现出许多原始特征，包括在中胚层分化中起重要作用的VTN的高表达，与ISC（肠干细胞）相比表现出更少的LGR5表达，以及参与上皮发育的ONECUT2表达。这些细胞还独特表达TF GATA4，其表达在12 PCW后大量丢失（图5a）。这些细胞（图5b），证实了铁代谢在绒毛形成中的重要性。
LGR5是一个特征明确的ISC基因，在早期妊娠期（<12 PCW）中在近端/远端ISC和茎状祖细胞中低水平弥漫性表达（图5b）。原位杂交（ISH）证实了在10 PCW处LGR5弥漫性表达，后被定位于隐窝基层（图5c），即使在隐窝形态建立之后（例如19 PCW之后），ISC仍分别构成远端/近端样本中捕获的上皮细胞的18％–22％，高于在成年结肠的scRNA-seq研究中3％-4％的捕获情况。
图5 上皮细胞簇marker表达、GATA4、LGR5原位杂交验证
⑤ 特殊的神经-上皮通路是ISC发育的开始
分泌型谱系细胞在12 PCW时出现，在8-10 PCW时检测到很少的杯状细胞。然而，在12 PCW后，杯状细胞和EEC逐渐增加，反映出持续的成熟趋势（图4a和6a），分泌细胞进一步细分为11个簇，反映了不同的EEC亚型（A / M，D和肠嗜铬/ I / L / N细胞）以及SI特异性Paneth细胞，杯状细胞和NEUROG3+祖细胞。
RL映射建立了主要的EEC信号传导回路，例如肠嗜铬细胞，主要在12 PCW的结肠中见到，它通过多种途径与抑制性运动神经元相互作用，包括TPH1-HTR2B，这是食欲/运动中的5-羟色胺信号传导途径（图6b）。因此，EEC多样性和相关网络在很大程度上与隐窝形成一起建立。
相比之下，BEST4 / OTOP2细胞出现在隐窝形成之前的最早时间点，已经在转录上有所区别（图6c），并且频率没有随时间变化（图6d），表明它们的发育可能与正常隐窝绒毛通路无关。
RL分析预测BEST4 / OTOP2与神经元细胞之间也有很强的相互作用（也在发育的早期建立）。
图6 杯状细胞、EEC细胞统计，TPH1-HTR2B信号途径，BEST4原位杂交及BEST4/OTOP2细胞统计
⑥ 跨区域的协调发育
肠发育需要来自三个胚层的细胞类型之间的精确相互作用，根据8个部分的转录，时间和位置分布对78种非上皮细胞簇（1个成纤维细胞簇，4个成肌纤维细胞簇，2个间皮细胞簇，12个内皮细胞簇，8个周细胞簇，13个神经细胞簇，12个免疫细胞簇和11个肌肉细胞簇）进行了分类，在这些细胞中，作者观察到协调分化，一些细胞群首先出现，因此可能建立了关键的生态位，为其他细胞铺平了道路，而在另一些细胞群体中，则是共定位协同进化的。
⑦ 肠道血管的生成建立
转录标签通常对应于结构特征，在内皮细胞中清楚地看到了这一点，将内皮细胞分为静脉，动脉和淋巴管类型，并根据血管大小进行了进一步区分（图7a）。在发育过程中，作者观察到了从小血管内皮细胞到大血管内皮细胞的过渡，反映了肠道血管生成。
相对于内皮细胞，周细胞亚型由血管生成驱动因子（PRRX1,THBS4和ANGPT2）定义。周细胞群显示出发育滞后， 为了解相应的分化动力学，研究人员将G2M和S期周细胞与G1期细胞在发育时间内进行了比较，表明在较早时间点的大多数细胞都是高度循环的祖细胞（图7b）。
图7 内皮细胞分群及不同时期细胞类型统计
⑧ 肠神经系统和固有肌层
与PCW7-8晚期发展出现的细胞类型相反，肠神经嵴来源的细胞沿胃肠道迁移，以形成包含神经元和神经胶质细胞的粘膜下层和肌间神经丛。
作者在研究的最早时间点（图8a）确定了不同的神经元和神经胶质祖细胞，并捕获了5个神经胶质细胞簇和7个神经元簇。在ST中，肠道神经系统成分也清楚地看到分布在肠道肌层（图8b）。
在成年肠道中，神经元丛被肌肉包围。祖细胞和分化的肠平滑肌细胞（iSMCs）分别由PLPP2和ACTA2等基因标记。研究确定了11个与iSMC相关的簇，包括PDGFRA+间质和Cajal间质细胞的早期细胞群（图8c）。通过10 PCW观察到内（IM）和外（OM）肌肉的形成。这些层在胎儿肠中的发育顺序尚不清楚。
另外，对于分化，其中结肠肌层落后于更成熟的近端组织—早期样本被祖细胞占据主导，而分化的远端肌层粘膜（MM），OM和IM细胞大量出现在12PCW后（图8d）。
图8 不同时期神经元及胶质祖细胞统计，神经细胞肠道肌层分布，肠平滑肌细胞簇分群，不同肌层细胞不同发育时期统计
⑨ 发育中的固有层肠间质细胞
随着肠的发育，这些不同的肠腔由间充质细胞支持，间充质细胞是研究图谱中最大的部分（24,081个细胞），作者将成纤维细胞第1-4层（S1-S4）根据时间，位置和周期中差异进一步将它们细分为16个类（图9a）。
S1细胞的3个簇形成了粘膜下结构细胞的大部分，而S2细胞（由F3,NPY和FOXL1标记）表达的标志物类似于隐窝的特洛细胞群，与成人相反，S3样细胞不仅在子宫内构成主要的成纤维细胞群，而且还表现出更大的异质性。
轨迹分析确定了一个分支点，其中未成熟的S3样细胞分为S3或S1 / 2/4谱系，可以通过谱系特异性TF网络进行区分（图9b）。
为了更好地理解S3亚型功能，作者研究了RL相互作用， 发现其中多是通过调节结肠成纤维细胞中组织纤溶酶原激活的受体LRP1介导的，为了在ST数据中证实这一点，进行了RL空间共表达分析，该分析确定了在空间上共定位的RL对，比如在成年人和胎儿组织中观察到LRP1与配体HSPG2（血管细胞外基质的关键成分）的显着共定位（图9c）。
在胎儿ST切片中， 将一些S3特异性基因（例如C7）的表达定位于成年组织中与脉管结构相邻的spot上， 将胎儿细胞类型的标签转移到成人ST切片上，结果显示S3 HAND1+和S3 EBF+细胞的成年对应物聚集在大血管周围（图9d）。这突显了这些细胞在形成肠血管支持方面的可能作用。
图9 成纤维细胞分群及轨迹分析，LRP1与配体HSPG2共定位，S3 HAND1+和S3 EBF+细胞空间分布
⑩ 形态发育梯度的无偏图指导肠道发育
理解肠道发育的基本是局部形态发生素梯度及其拮抗剂如何影响肠道绒毛的形态发生。作者创建了一个涉及8条途径的基因的形态发生图（图10a），以阐明这些分子在空间和时间上的作用。
共表达分析确定了11种细胞类型特异性和13种空间共定位的形态发生模块（图10b），并在所有ST切片中对模块活性进行了评分。
图10 形态发生分子STRING相互作用组的图形可视化，细胞类型模块与空间模块共定位
⑪ S2成纤维细胞具有特定位置并控制上皮形成
隐周S2成纤维细胞或末梢细胞通过表达来自转化生长因子β（TGF-β）超家族和WNT途径的配体提供上皮支持。研究从TGF-β（BMP2,BMP4和BMP5）和非典型WNT途径（WNT5A和WNT5B）中发现了三个主要的S2簇。这些S2特异性基因形成了主要的粘膜下成纤维细胞形态发生模块（scRNA-seq模块2）的一部分，该模块包含DLL1,BMP5和NRG1（图11a）。这突显了S2细胞及其所提供的富含上皮素的利基在上皮细胞形成中的重要性。
最后，研究确认了S2 marker 基因F3在隐窝形成之前就已经存在，并且形成的小丘随着绒毛的形成而向上增加（图11b）。因此，在人的肠中，S2型成纤维细胞不仅是上皮隐窝利基维持所必需的，而且在其形成中也可能起积极作用。
图11 S2成纤维细胞定位及其marker基因F3在不同发育时期的原位杂交定位
⑫ 人肠道的免疫发育
1）淋巴组织形成过程中的免疫细胞异质性
本研究捕获了从6个谱系（巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、适应性和先天性淋巴样细胞）出现的整个发育过程中的2,199个免疫细胞（图12a）。免疫细胞在SI中（占捕获的所有细胞的3％– 8％）比结肠（占1％– 2.5％的平均）更为普遍，总体而言在孕早期之前非常罕见。
在10 PCW之前，研究人员观察到髓样细胞的富集，而在12 PCW时，出现了大量的 naïve CD4 +和CD8 + T细胞，自然杀伤细胞（NK），1型先天淋巴样细胞（ILC）和3型ILC（图12b）。
胎儿ILC3表达IL7RA和ID2，这对小鼠子宫Peyer’s斑块（PPs）的形成至关重要，因此将这些细胞区分为3型淋巴组织诱导剂（LTi）。PP的形成是一个LTi细胞、EC和基质细胞之间相互协调作用的过程。此外，鼠类研究显示其还需要RET/ARTN/GFRA3神经轴，而GFRA3缺乏会导致PP发育受损。肠道相关淋巴样组织（GALT）的形成被认为在出生前以PPs的形式出现在SI体内，而在出生后以结肠的形式出现。在此研究中，确定了一个独特的结肠特异的神经胶质细胞群，它是发育过程中唯一的GFRA3来源，并在15 PCW时扩展（图12 c），表明在人类结肠发育过程中可能存在类似的神经免疫通路。
图12 肠道免疫细胞分群，不同时间点免疫细胞统计，结肠特异性神经胶质细胞群
2）S4成纤维细胞是淋巴结构形成和维持的关键
PP形成的其他关键介质包括通过CCL19,CCL21促进LTi组织归巢的基质组织细胞。研究人员发现这些特异性地定位于两个S4成纤维细胞簇，并且表达随着发育而增加。在S4簇中绘制RL相互作用的图谱突出显示了与各种免疫细胞的相互作用。这进一步支持了S4在淋巴样组织(GALT)形成中的作用。
作者进一步在空间上确认了这些相互作用，研究了成人ST切片，证实了各种成熟免疫细胞（B细胞，T细胞和髓样细胞）和此处定位的S4细胞类型（图13a）。研究人员还发现ST中关键RL对的显著共定位（图13b）。表明S4细胞是成年结肠中与卵泡相邻的成纤维细胞，在胎儿GALT发育过程中以时间依赖性方式出现。
两个S4簇在很大程度上都是SI特异的，维持PP的子宫发育，但不维持结肠GALT，并且在12 PCW之前完全不存在。研究比较了两个S4簇的转录谱，发现S4 CXCL13 +亚型表现出许多隐性S2成纤维细胞的关键特征，其缺陷导致PP形成受损，并且是PP中M细胞分化所必需的。综上，PP中相同的隐周成纤维细胞起着上皮隐窝支持、淋巴组织形成的协调以及介导间质免疫互作，从而揭示了它们的高度动态的作用。
图13 S4与免疫细胞空间定位及RL对的显著共定位
⑬ 绘制先天性肠道疾病的细胞基础
为了揭示可能导致先天性肠道疾病的时间关键性转录缺陷，研究人员将数据与人类表型术语集（HPO）的围生期肠道疾病列表相关联，并注明了遗传表型。通过将749个已知的疾病基因与本研究中的scRNA-seq数据整合在一起，将先天性疾病与可能通过高度细胞类型特异性缺陷表现出来的表型联系起来，这些表型导致肠道、腹侧、会阴、神经节、炎症或肿瘤病理等。
本研究在时间方面可以通过对随发育时间变化的疾病基因进行研究，从而提出与时间相关的疾病的见解。例如HMGA2是12 PCW前胶质细胞和IM祖细胞表达的基因（与肠道畸形相关），早期抑制性运动神经元特异性NXN的致病变异可导致卵泡扩张等。
研究结果
本研究对完整厚度的肠组织利用单细胞和空间技术绘制了所有肠腔的发育图谱。数据涵盖了几个关键的发育事件-上皮隐窝-绒毛形成，间质的分化，肌肉层的建立，血管系统的扩张，免疫定殖和GALT的出现。作者提出了对不同细胞群体协调出现的见解，定义了调节其发育的TF和细胞通讯网络。最后，本研究还建立了胎儿肠道发育的时空分析的高维度数据资源集。
参考文献：
Fawkner-Corbett D, Antanaviciute A, Parikh K, et al. Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution. Cell, 2021, 184: 1–17.
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