基因敲除是指使生物体基因组中的特定基因失活或失效的过程。通常是通过在靶基因中引入突变来实现的，使其失去功能。进行基因敲除的方法，包括同源重组、RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9。同源重组即通过引入修饰的DNA片段，用无功能或被破坏的版本替换靶基因；RNAi利用小RNA分子来沉默或降解靶基因的信使RNA（mRNA），阻止其翻译为蛋白质；CRISPR/Cas9是一种革命性的基因编辑工具，它使用引导RNA（sgRNA）和Cas9酶在基因组的特定位置引入靶向DNA断裂，导致基因破坏。
基因敲除的sgRNA如何设计？
在 CRISPR-Cas9 系统中，sgRNA（small guide RNA，sgRNA）通过碱基互补配对原则引导 Cas9 蛋白酶 至基因组特定的靶序列上，Cas9 蛋白与 PAM 序列结合后便可对靶位点进行切割，形成 DNA 双链切口。sgRNA 设计的合理与否，对于 CRISPR-Cas9 编辑系统的切割效率，甚至最后能否得到 KO 细胞具有重要影响。
目前虽然有诸多高效快速的 gRNA 设计工具，但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。sgRNA 的设计需要遵循以下原则：
(1) 不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域，且能影 响蛋白的功能结构域。
(2) 尽可能影响所有的转录本，敲除位点最好在编码区的前 50%，但避免敲除 ATG 所在外显子或 ATG 之 前的外显子。
(3) 片段敲除的 sgRNA 设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后 序列尽量简单，方便后续的 PCR 鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非 3 的倍数，使靶区域后面 的序列发生移码。另外，片段敲除所选定的敲除区域不要超过 10 Kb，超过 10 Kb 后编辑敲除效率会降低。
(4) 在设计 sgRNA 时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC 含量、潜在的脱靶位点等信息。例如靶点的 GC%尽量不要低于 40%，靶点序列 GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不 要有连续 4 个以上的 T 碱基，避免形成 RNA Pol III 的转录终止信号等。
(5) 当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的 cell pool 阶段检测效率呈显著下 降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用 RNAi。
(6) 由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果 RNAi 始终做不出表型，但从有 关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做 KO；另外，研究的目的基因处于非转录区域，或者 目的基因有很强的转录效率，也是无法用 RNAi 进行有效干扰的，则建议做 KO，且 KO 细胞更适合进 行回补实验。
(7) 最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用 RNAi 做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然 可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。
如何避免脱靶效应？
研究表明，sgRNA 通常会与基因组 DNA 发生一定概率的序列错配，从而引起非预期的基因组编辑，即 所谓的脱靶效应（Off-target effects）。为了尽可能避免脱靶效应，可以通过以下几点进行优化：
(1) 提高 sgRNA 特异性。在设计 sgRNA 序列时，可选择 GC 含量在 50%~70%，与靶基因序列之外的基因 组 DNA 同源性较低的 sgRNA 序列，同时还可以选择在 sgRNA 的 5’端增加 2 个鸟嘌呤，来提高 sgRNA 的特异性。
(2) 控制 Cas9-sgRNA 用量。通过控制 Cas9 蛋白或 sgRNA 的表达量来减少脱靶效应，细胞中持续表达 Cas9 将增加脱靶风险，因此可以通过 Cas9 蛋白的抑制剂来降低 Cas9 活性，降低脱靶效应。尽管通过调节 sgRNA 和 Cas9 浓度可降低脱靶风险，但浓度降低后，相应的基因组编辑能力也会减弱，要根据实际情 况选择合适的 gRNA 和 Cas9 复合物比值。
(3) 改造 Cas9。通过对野生型 Cas9 进行改造提高 CRISPR-Cas9 系统的特异性，可将 Cas9 中的一个酶切位 点失活，得到突变型切口酶，由于突变型 Cas9 只能对单链进行切割，因此需要 2 条 sgRNA 同时引导， 在 DNA 不同的链产生 2 个相近的切口，才能引起双链 DNA 断裂。只有 2 条 sgRNA 均发生错配时才会 发生脱靶，这极大降低了脱靶效应。
(4) 选择合适的递送载体。目前 Cas9 可以通过 DNA 质粒、病毒和蛋白质三种方式传递到靶细胞中，利用 Cas9/sgRNA 核糖核蛋白（ribonucleoproteins，RNPs）递送系统不会在被编辑的细胞基因组中插入外源 DNA 序列，可有效减少脱靶效应。
如何检测脱靶？
一直以来，CRISPR 系统的脱靶效应尚未得到有效的解决，因此对于脱靶效率的检测也有不少研究。
针对细胞外的检测方法有：
(1) Digenome-seq Digested genome sequencing，通过 Cas9 核酸酶体外切割后提基因组 DNA，进行高通量测 序，鉴定脱位点，生物信息学分析来检测脱靶情况。
(2) CIRCLE-seq，将基因组片段化之后自连接环化，然后用 Cas9 复合物处理将提取的 DNA 断裂成 300 bp 后再环化，加入 gRNA 和 Cas9，含有靶标序列的环形 DNA 会被切割成线性 DNA，再对线性的 DNA 进行高通量测序。
(3) SITE-Seq，在细胞外将 DNA 在 sgRNPs 处理后进行高通量测序，该技术使用了 sgRNA 编程的 Cas9 对 基因组 DNA 中的剪切位点序列进行识别。
细胞内的检测方法有：
(1) GUIDE-seq，在细胞内通过 Cas9 切割产生双链断裂后，以非同源性末端接合的方法，引入一段短双链 寡核苷酸来标记 CRISPR-Cas9 诱导的脱靶断裂，高通量测序确定脱靶位置。
(2) DISCOVER-Seq，利用 DNA 修复因子结合染色质免疫共沉淀和高通量测序的方法，可以识别出 CRISPR 在基因组中切割的的确切位置。
(3) GOTI，利用双细胞胚胎注射 RNA 和 Cas9 来评估脱靶效应。用流式细胞技术分选出小鼠胚胎基因编辑 细胞和未编辑细胞，全基因组测序进行差异比较分析。
CRISPR/Cas9系统的活性检测方法有哪些?
通常我们都是采用各个设计网站预测，得到我们的 gRNA，那如何能够快速、准确的验证 CRISPR-Cas9 系统是否能发挥作用呢？
(1) 荧光活性检测法。在 Cas9 和 gRNA 的作用下，靶点位置的双链 DNA 会被切割形成 DSB，细胞通过同 源重组形成有活性的荧光蛋白，可通过流式细胞仪来检测荧光强度是否增强，以此来判断 Cas9 及 gRNA 的活性及敲除效率。
(2) 错配酶法。对修饰后的靶序列进行 PCR 扩增过程中，会形成含有错配的 DNA 双链，将经过错配酶切 割后的产物进行凝胶电泳，检测 CRISPR-Cas9 系统的切割活性。
(3) 套峰检测法。对修饰后的靶序列进行 PCR 并测序，通过分析 Spacer 区域套峰情况来分析 CRISPR-Cas9 系统的活性。
CRISPR/Cas9系统的活性检测方法有哪些?
通常我们都是采用各个设计网站预测，得到我们的 gRNA，那如何能够快速、准确的验证 CRISPR-Cas9 系统是否能发挥作用呢？
(1) 荧光活性检测法。在 Cas9 和 gRNA 的作用下，靶点位置的双链 DNA 会被切割形成 DSB，细胞通过同 源重组形成有活性的荧光蛋白，可通过流式细胞仪来检测荧光强度是否增强，以此来判断 Cas9 及 gRNA 的活性及敲除效率。
(2) 错配酶法。对修饰后的靶序列进行 PCR 扩增过程中，会形成含有错配的 DNA 双链，将经过错配酶切 割后的产物进行凝胶电泳，检测 CRISPR-Cas9 系统的切割活性。
(3) 套峰检测法。对修饰后的靶序列进行 PCR 并测序，通过分析 Spacer 区域套峰情况来分析 CRISPR-Cas9 系统的活性。
基因敲除的主要技术手段、技术原理和技术特点
总结：蛋白法不需要构建载体，最快捷，但gRNA容易降解、操作需要十分小心。常规瞬转质粒法构建简单，但是效率低。病毒法效率高，但是周期长，成本更高。
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