细胞冻存注意事项

细胞培养时经常会遇到细胞运输或者长期不用某种细胞，这个时候就需要将细胞冻存起来方便后续使用。若未做好细胞冻存，则会影响后续细胞复苏状态，所以细胞冻存的重要性不容小觑。

今天小海星就为大家介绍一下细胞冻存中的需要注意的一些事项（供参考）

贴壁/半贴壁细胞冻存

① 将待操作的细胞去上清（半贴壁细胞需收集培养上清液），用37℃预热的PBS润洗1-2次；

② 去上清，加入37℃预热胰酶消化，消化完成后加入37℃预热的完全培养基终止消化，并吹打均匀制备成细胞悬液；

③ 250g离心4min后尽量吸干净上清，收集细胞沉淀；

④ 加入配置好的冻存液重悬，一个T25培养瓶长到80%左右密度的细胞量可冻存1支，或者细胞计数后，按照1-2×106cells/支冻存，冻存液用量推荐0.5-1mL/支；

⑤ 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱24h（若您使用的是无血清一步冻存液，则无需程序降温盒）；随后将冻存管转移至液氮长期保存。

悬浮细胞冻存

① 直接将细胞悬液于250g离心3分钟后尽量吸干净上清，收集细胞沉淀；

② 去上清，用配置好的冻存液重悬细胞，一个T25培养瓶长到传代密度时的细胞量可冻存1支，或者细胞计数后，按照1-2×106cells/支冻存，冻存液用量推荐0.5-1mL/支；

③ 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱24h（若您使用的是无血清一步冻存液，则无需程序降温盒）；随后转移至液氮长期保存。

细胞冻存注意事项

① 细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；

② 应选择对数期生长，细胞汇合度80%-90%左右的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；

③ 程序降温盒和常规冻存液需室温备用，完全培养基、胰酶和PBS需37℃预热；

④ 冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤；

⑤ 冻存细胞长期保存应放置于液氮，不建议在-80℃长期保存；

⑥ 若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化。