心力衰竭(HF)是心肌梗死(MI)的常见后果。通过鉴别MI后不同阶段炎症细胞的组成可能为建立新的生物标志物和治疗方法提供线索。本研究通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组学相结合，探索MI小鼠模型中与心肌梗死相关的免疫细胞时空动态。通过scRNA-seq鉴定出12个主要的免疫细胞群，并且这些细胞群的比例在MI后发生动态改变。其中巨噬细胞是最丰富的群体（>为60%，除心肌梗死后第1天外）。通过轨迹分析发现，心肌梗死后晚期巨噬细胞中Trem2的表达上调，体内注射可溶性Trem2可显著改善梗死心脏的功能和结构。本研究有助于更好地理解心肌梗死驱动的免疫反应，并且通过进一步研究Trem2信号通路的调控因子，将有利于探索心肌梗死后心衰的新治疗策略。
文章题目：Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2hi macrophages in infarcted hearts
中文题目：单细胞测序--揭示心肌梗死中巨噬细胞异质性的时空动力学和Trem2hi巨噬细胞的潜在功能
发表日期：2022.08
期刊名称：Nature communications
影响因子：17.694
实验平台：10x Chromium 单细胞转录组测序、10x Genomics 空间转录组学
DOI：10.1038/s41467-022-32284-2.
研究内容
心肌梗死后的免疫细胞动力学研究
为了获得心脏缺血损伤后免疫细胞图谱，研究者分别在MI后第1、3、5和7天通过流式细胞术分离小鼠CD45+白细胞（梗死和梗死周围区域）并进行scRNA-seq测序。将处于稳态（MI前）的CD45+细胞作为对照。所有时间点共捕获33977个细胞，聚类注释后得到12个的细胞簇(cluster)。其中最丰富的细胞群是巨噬细胞。在MI前，巨噬细胞占比最高，但在MI后第1天急剧下降，从MI后第3天开始恢复，在MI后第7天达到峰值。相反，中性粒细胞的比例在第1天增加，然后迅速下降。一些其他细胞类型也呈时间依赖性变化，例如，单核细胞在MI早期（第1天和第3天）增加，在MI晚期（第5天和第7天）减少；淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞和ILC2细胞)在MI第1天下降，直到MI后第7天才达到稳定值。单细胞测序数据表明，不同的细胞群在心肌梗死后的随时间动态变化具有差异。
Fig.1 MI后时间依赖性免疫细胞的动态改变
心肌梗死后免疫细胞的时空分布
为了验证上述浸润到梗死区域的免疫细胞，研究者对心肌梗死后第1、3、5和7天的冷冻样本进行空间转录组测序（ST-seq），在每个样本中确定4-5个细胞簇。接下来进一步研究每个spot中的细胞类型组成。结果显示，中性粒细胞在MI后第1天高度浸润到梗死区域，但随后数量迅速减少（在MI第3、5和7天）；巨噬细胞从MI后第3天开始浸润到梗死区域，其丰度在心肌梗死晚期达到高峰（MI后第5天和第7天）；单核细胞和成纤维细胞也以时间依赖性的方式浸润心脏梗死区域；其他免疫细胞群（如B和T细胞群）丰度非常低，分散在整个小鼠心脏（不聚集在梗死区域）。MI后不同时间点的ST-seq与scRNA-seq数据相结合，结果说明心肌梗死早期单核细胞和中性粒细胞浸润到梗死区域，而巨噬细胞和成纤维细胞的作用相反。
Fig.2 心肌梗死后小鼠心脏的空间转录组测序
心肌梗死后单核细胞和巨噬细胞的异质性及其时间动态改变
scRNA-seq结果显示，巨噬细胞是心脏中最大的免疫细胞群体。为了进一步了解MI后巨噬细胞亚型的动态变化，研究者进行了亚聚类分析，共获得了16个亚细胞群。其中3个巨噬细胞亚簇（簇1、3和13）在MI前细胞占比高，研究者将其命名为稳态巨噬细胞(SS-Mφ)簇。差异基因分析显示，SS-Mφ1（簇3）中，Lyve1、F13a1等巨噬细胞相关基因的表达升高；SS-Mφ2簇（簇1）显示出相对较高的抗原呈递相关基因的表达；在SS-Mφ3簇（簇13）中均检测到SS-Mφ1和SS-Mφ2的标记基因，表明这些细胞处于介于SS-Mφ1和SS-Mφ2簇之间的中间状态。在MI早期阶段（第1和3天），单核细胞和两个巨噬细胞簇细胞在单核/巨噬细胞总数中占比高（簇4、10和14），称为Early-Mφ簇。在MI晚期（第5和7天），4个巨噬细胞簇占比高（SS-Mφ1、SS-Mφ2、簇2和簇5），称为Late-Mφ簇；此外，研究者还发现了3个巨噬细胞群体，2个富含干扰素刺激基因的巨噬细胞群体，以及2个增殖群体（比例较低），这些细胞群在簇6和簇15中富集，表达许多与干扰素信号相关的基因，如Irf7、Isg15和Ifit2，因此被定义为IFN-Mφ。以上亚聚类分析揭示了巨噬细胞的异质性，以及巨噬细胞/单核细胞的时间动态改变，Late-Mφ和SS-Mφ簇可能在减弱心肌梗死后的炎症反应和促进组织修复方面具有重要功能。
Fig.3 单核/巨噬细胞亚群
梗死心脏的单细胞运动轨迹
为了更好地了解单核/巨噬细胞浸润到梗死区域的过程，研究者使用Monocle R包进行轨迹分析。结果显示，以Ly6c2hi单核细胞为根时，细胞按Early-Mφ、Transient-Mφ和Late-Mφ的顺序增加。然而，Transient-Mφ1和IFN-Mφ种群在相对较早的时间内发生了分化，而Transient-Mφ1与Late-Mφ没有联系。接下来研究每个细胞群中特异性表达的基因随时间的变化。结果显示：Early-Mφ特异性基因在Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中表达上调，然后在Transient-Mφ中逐渐降低，在Late-Mφ细胞中达到低水平。相反，Late-Mφ特异性基因在Ly6c2himonocytes/Early-Mφ中下调，然后在瞬时Mφ和Late-Mφ细胞中逐渐上调。值得注意的是，在梗死的心脏组织中使用ST-seq检查基因的表达以及巨噬细胞亚群的比例时发现，每个亚群的标记基因和比例以时间依赖性的方式富集在心脏梗死区域，而SSMφ1细胞在心肌梗死后的所有时间点都分散在心脏中。
Fig.4 单核/巨噬细胞运动轨迹
中性粒细胞和树突状细胞亚群
中性粒细胞是MI后第一天内最大的细胞群，接下来进一步鉴定5个不同的中性粒细胞亚簇（图4a），研究不同阶段中性粒细胞和DC细胞占比及基因改变。结果显示，MI前cluster 1和cluster 3占比高，而在MI后第1天cluster 3的比例明显下降，在MI后第7天逐渐增加，MI后cluster 1没有明显变化的趋势。相反，MI前cluster 2的占比较少，但在MI后第1天显著增加，并在第3天达到峰值。cluster 4高表达与干扰素信号相关的基因，Hspa5、Dnajb9f和Hyou1等上调。对于DC细胞，鉴定出6个不同的亚簇，其中cluster 2、3和4在MI死前占比高，但在MI后第5天比例逐渐下降。cluster 4表现出明显的转录状态，高表达Xcr1和Clec9a；cluster 6中浆细胞样DC标记基因的上调。
Fig.5 中性粒细胞和DC细胞亚群
心肌梗死后Trem2的表达
先前的研究表明，在动脉粥样硬化进展过程中，小鼠心脏中Trem2的表达增加。在本研究中，免疫组化显示，MI后梗死区Trem2的表达逐渐增加。WB结果显示，full-lengthTrem2的表达量逐渐增加，在MI后第5天达到峰值；而solubleTrem2 (sTrem2)在MI后第3天后增加，并在第7天达到峰值。接下来，通过共定位实验，验证Trem2hi巨噬细胞是否是MI后Trem2表达模式的主要细胞群。结果显示，Trem2信号与CD68+信号共定位（CD68+巨噬细胞在梗死区域明显增加），说明Trem2过表达主要发生在巨噬细胞中。此外，研究者还评估了MI后第3天和第5天，在 Trem2hi and Trem2low细胞中sTrem2的分泌水平，结果发现sTrem2仅在Trem2hi巨噬细胞中分泌，并且sTrem2水平在MI第5天明显高于第3天。这些结果表明Trem2在梗死心脏的巨噬细胞中高表达，而sTrem2只由Trem2hi巨噬细胞分泌。
Fig.6 MI后心脏中Trem2的表达
MI后期Trem2hi巨噬细胞在损伤心脏中发挥抗炎作用
接下来通过流式细胞数术分离心肌梗死小鼠模型中Trem2巨噬细胞的主要亚群进行鉴定，包括MI早期和晚期的Ccr2hi和Trem2hi巨噬细胞。结果显示，Ccr2hi巨噬细胞的比例在MI后第1天迅速增加，然后逐渐下降，说明巨噬细胞被招募到梗死区域（与scRNA-seq数据分析一致）。Trem2hi巨噬细胞的比例在MI后第3天开始增加，在第5天达到峰值，说明Trem2h主要在MI晚期发挥功能。Ccr2hi和Trem2hi巨噬细胞亚群基因分析结果显示Ccr2hi巨噬细胞促炎因子相关基因的表达更高，而Trem2hi巨噬细胞则表达更高水平的抗炎因子相关基因。以上结果表明，Trem2hi细胞可能具有抗炎巨噬细胞的特性。这些数据表明Trem2hi巨噬细胞在心肌梗死晚期占主导地位，并具有抗炎特性。
Fig.7 MI后期心脏中Trem2hi的功能
体内注射可溶性soluble Trem2后左心室重构明显改善
为了验证sTrem2对心肌梗死后重构的影响，研究者向MI小鼠注射sTrem2，与对照组MI小鼠比较。结果显示，sTrem2组小鼠MI后28天左心室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)和收缩末期容积(ESV)显著降低；左室扩张和重构良好，梗死壁更厚，纤维化更低；sTrem2组小鼠的梗死面积明显小于对照组小鼠，存活率明显增加。总之，这些结果表明，sTrem2在体内促进了梗死心脏的功能和结构的改善。
Fig.8 注射soluble Trem2(sTrem2)对梗死心脏的影响
主要结论
本研究探索巨噬细胞异质性的时空动态及Trem2hi巨噬细胞在心脏组织修复中的潜在功能，绘制了MI后梗死心脏的一个全面的单细胞和空间转录组图谱。对目前理解心肌梗死驱动的免疫反应做出了重要贡献，并且对与Trem2信号通路调控因子的深入研究将有助于建立心肌梗死后心衰的新治疗策略。
四. 参考文献
Jung SH, Hwang BH, Shin S, et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2himacrophages in infarcted hearts.Nat Commun. 2022;13(1):4580. Published 2022 Aug 6.
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