今天跟大家分享的是十一月份发表在EBioMedicine杂志上的一篇文章，
Identification of an immunotherapy-responsive molecular subtype of bladder cancer
膀胱癌的免疫治疗应答性分子亚型的鉴定
尽管已经研究了膀胱癌（BC）的各种分子亚型，但大多数研究集中在肌肉浸润性BC（MIBC）上，没有一项研究对早期BC患者的进行性NMIBC或基于免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗应答进行分类。研究考虑了BC的四种分子亚型，构建的分类系统为BC的每个亚类提出了生物学活性和潜在的治疗指南，尤其是具有ICI应答性的第3类的预后和预测意义。第3类亚型与ICI应答之间的密切关联可能为高度进展的NMIBC和MIBC且预后较差的患者提供合适的治疗选择，为BC精准医学做出贡献。
一、材料和方法
1. 患者和基因表达数据
从GEO数据库获得与BC中基因表达有关的微阵列数据集。来自忠北国立大学医院的原发性BC患者的基因表达和临床数据被用作发现队列（CNUH队列），亚型验证使用了延世大学附属医院（YUSH队列），隆德大学医院（UHL队列）和瑞典南部医疗区（SSH队列）的BC基因表达数据集，分别从GEO，ArrayExpress和Mariathasan的补充数据中下载了TCGA，UROMOL和IMvigor210的RNAseq数据集，从UCSC Xena Browser和European Genome-Phenome Archive中收集了来自TCGA和UROMOL队列的突变数据。
2. 基因表达分析
将所有基因表达数据集分别进行log2转化和分位数归一化，进行聚类分析。发现队列中由基因表达矩阵的无监督聚类显示了四个具有不同基因表达模式的聚类。层次聚类分析使用Gene Cluster 3.0进行，并使用Java TreeView进行可视化。
3. 建立基于基因的分类器
应用微阵列（SAM）显著性分析识别每种亚型中显著差异表达的基因。在CNUH队列的四个亚型中选择了表达水平差异最大的基因。使用微阵列预测分析（PAM）对基因进行了训练，以构建基于基因的分类器（R包：PAMR）。
4. 验证队列的亚型分类
对于RNA-seq数据集进行处理，使用基于发现队列构建的PAM分类器将其独立分配给BC亚型。对每个数据集使用基于发现队列构建的分类器进行分类。
5. 突变显著性分析
使用来自TCGA队列的体细胞突变数据，研究突变谱、涉及致癌信号的基因以及DNA损伤应答和修复（DDR）。在UROMOL队列中研究FGFR3，涉及致癌信号的基因和DDR突变谱。
6. 分析第3类与对ICI应答之间的关联
检查来自IMvigor210队列的接受抗PD-L1药物（阿托珠单抗）治疗的转移性尿路上皮癌患者的肿瘤。从IMvigor210CoreBiologies获得患者的RNA-seq数据和临床信息，使用广义线性模型评估BC亚型预测ICI应答的独立效用。
7. 统计分析
卡方检验和双样本t检验分别用于评估类别变量和连续变量的组间差异，使用对数秩检验来估计亚型和生存结果之间的关联。
二、结果
1. 通过层次聚类识别BC亚型
聚类分析显示了四种不同的BC亚型，应用PAM算法后保留了由786个预测误差最低的基因组成的最终亚型特异性特征。将由786个基因（GSP786）定义的这种基因组亚型预测应用于CNUH队列的患者，并获得亚型分层（图1a）。第1类的肿瘤样本主要包括低级NMIBC。第2类包括低级NMIBC和少量MIBC，显示免疫应答途径的下调。第3类表现出相似的高等级NMIBC和MIBC的参与（图1a）。大多数T1高度肿瘤被归为第3类，这表明第3类可能能够检测出具有进行性疾病的高风险NMIBC。第3类显示了细胞周期的激活相关功能和Notch信号通路中相关基因的抑制作用，检查这些基因在NMIBC和MIBC中的表达水平，观察到这些基因在第3类中的表达增加。无论NMIBC和MIBC的病理亚型如何，第3类可能具有适合预测肿瘤侵袭性临床行为的独特分子特征。包含最多MIBC病例的第4类表现出与细胞外基质组织有关的基因的明显上调以及免疫应答激活。
2. 独立队列中基于GSP786的亚型分类
将分类器应用于四个验证队列（图1b），第1类仍显示出对细胞增殖相关基因的一致抑制，RNA-seq队列中第2类和第3类的样本组成与CNUH队列中的相似。大多数患有GU的肿瘤被分为第3类，而具有浸润亚型的肿瘤被分为第4类（图1b）。结果强调了预测因子在准确反映GU和浸润亚型之间的分子差异方面的相关性。第4类显示了与EMT或成肌纤维细胞有关的基因的上调与肿瘤的分期或等级无关。在YUSH，UHL和SSH中确定了四种亚型队列，表明GSP786分类的一致性和可信度。综上所述，分类器显示出一致的分子分类模式。
图1. 在CNUH和RNA-seq队列中使用GSP786分类器预测BC的四种分子亚型
3. 亚型的预后意义
比较独立队列中这些亚型之间的患者存活率，发现在CNUH，YUSH，UHL和SSH队列的四个亚型中，癌症特异性生存率的统计学差异显著（图2a-d）。估计三个独立队列（UHL，SSH和RNA-seq队列）中NMIBC患者的PFS率，第3类中NMIBC的进展频率高于其他子类（图2e-g），反映了由于细胞周期异常导致的肿瘤侵袭性及其在对进行性疾病的高危NMIBC患者进行分类的预测价值。
图2. BC亚型的预后意义
4. 四种BC亚型的突变
使用TCGA队列中的体细胞突变数据来鉴定与这四个亚型相关的突变，第3类中的体细胞突变率显著提高（图3），表明在第3类肿瘤中DNA修复系统受到严重损害。分析UROMOL队列的突变数据，TP53的突变频率在3类和4类中显著增加，1类中FGFR3的频率高于其他亚类。在涉及DDR的基因中，第3类中BRCA1突变的频率增加，表明第3类表现出与DDR相关特征。
图3. TCGA队列中BC亚型突变
5. 第3类亚型与对ICI的应答之间的关联
通过GSP786鉴定这四种亚型，观察到第3类具有与对ICI的潜在应答相关的不同生物学特征和DDR中涉及的基因的改变（图3）。将GSP786应用于接受抗PD-L1药物治疗的BC前期IMvigor210队列，在患有第3类肿瘤的患者中观察到更高的应答率，表现出与细胞周期和DDR相关的基因表达增加（图4a和4b），第3类亚型的生存率要高于其他亚型（图4c），这表明第3类MIBC患者可能对ICI治疗有更好的应答。将Logistic回归模型拟合到数据中，第3类与对ICI的应答具有统计学上的显著关系，表明该亚型可独立用于对应答最好的患者亚类进行分类（表1）。因此，ICI可能作为具有高危NMIBC且可能发展为MIBC的第3类肿瘤的更积极的治疗选择。
图4. 第3类亚型与ICI应答相关
表1. 用于预测对ICI应答的Logistic回归分析
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