这一部分我们就以人p53CDS区为目的基因片段和pUC19为载体为例，讲解一下无缝克隆的具体操作流程。
一. 查找p53目的基因
1. 在NCBI中搜索栏换为Gene，并输入所要搜索的目的基因如p53。
选择Gene，输入p53
2. 在如图所示的搜索结果中，选择自己所需的基因，我们选择物种Homo sapiens(human)的TP53，点击并进入详细信息。
选择所需的物种
3. 点击NCBI Reference Sequences (RefSeq)或者往下翻，一直到mRNA and protein
查找NCBI Reference Sequences (RefSeq)
找到mRNA and protein，点击红色圈出的位置
4. 往下翻阅，找到TP53基因的详细信息，找到蛋白编码区CDS
找到CDS区域
5.进去CDS的序列，选择FASTA格式，进行复制。
找到CDS序列
二. 引物设计
1. In-Fusion/Takara 无缝克隆引物设计
这个为Takara试剂盒对应的引物设计网址：https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/primer-design-and-other-tools
1.1 在addgene中找到pUC19质粒序列，并复制。
2.2 打开引物设计界面
按照图中标注的，根据实验需求区选择合适的方法，填入序列；选择克隆还是突变；线性化选择；酶切位点选择；目的基因片段输入；填好之后点击Design Primers。
引物设计界面
下图为引物设计的结果，包括特异性引物序列，同源序列引物设计，Tm温度，Forward and Reverse Primers，也可以点击下载结果，结果中会包含全部序列和引物。
引物设计结果
后续无缝克隆过程
2. 天根EasyGeno对于引物设计 为此网址：http://123.56.75.195/
如图所示，选择线性化方式，选择插入片段个数，选择酶切位点以及选择是否保留酶切位点。
EasyGeno设计引物
引物设计结果
像赛默飞的https://www.thermofisher.com/order/oligoDesigner/ GeneArt 无缝克隆线上工具；NEB的http://nebuilder.neb.com/都可以用来设计引物。
之后定制引物，扩增，连接，按照各个厂商的试剂盒说明书步骤来，就能完成一次完美的无缝克隆。
关于无缝克隆这一部分，从基础原理到应用，具体操作流程大致介绍完了，最后小部分关于亚克隆和文库的构建没有多讲，其实就是利用上述所讲内容的具体应用。希望大家都能一次就顺利构建出自己所需的载体！！
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