“会读质粒图谱才能用好质粒。”
前面各个部分分别介绍了质粒的分类，复制起点，启动子，抗性以及蛋白纯化和鉴定标签，这部分将介绍蛋白标签的另一个常用应用----荧光蛋白标签和荧光素酶报告基因，也是质粒图谱简单介绍的最后一部分，后面将尽多尽可能简单的介绍常用质粒及图谱。
荧光蛋白有着丰富的应用可以观测细胞生命活动如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生等，可以用于表达蛋白的标记，可以用于生物体中标记。
荧光素酶报告基因系统以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统，通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
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荧光蛋白
绿色荧光蛋白(GFP)
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，蛋白分子量为27KDa，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现，发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。2008年10月8日，日本科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
EGFP：Enhanced Green Fluorescent Protein 即增强绿色荧光蛋白，EGFP是GFP突变系。应用较多的是 GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋 白(EGFP )，发射出的荧光强度比GFP大 6 倍以上，因此，比GFP更适合作为 一种报告基因来研究基因表达、 调控、 细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
激发光波长为488nm，发射波长为507nm，载体中构建Kozak序列使得EGFP的融合蛋白在真核系统中表达效率更高。荧光蛋白在细胞或生物体中给予激发波长就能够发出绿色荧光，显示目的基因的表达情况，且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针，不会干扰蛋白检测，快捷，灵敏，非常适用于高通量的药物筛选。
上图两个都是带有EGFP荧光蛋白标签的质粒，第一幅图中mEGFP中m表示monmer单体的缩写，荧光蛋白的形式为单体，这在很多实验设计中非常重要，比如与目的标记基因组成融合蛋白时。两张图主要区别点在于EGFP插入的位置不同，一个在N端，一个在C端。pmEGF-C1中EGFP插入在backbone的N端，多克隆位点MCS在C端，质粒命名为C1；pEGF-N1中，EGFP插入在backbone的C端，MCS在N端，质粒命名为N1。
红色荧光蛋白(mCherry)
mCherry是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定位等。不同于其它从维多利亚水母中分离的GFP蛋白和其它绿色荧光蛋白变体，mCherry以及其它大多数红色荧光蛋白是从珊瑚(Discosoma)中分离出来的蛋白，相对于其他荧光，mCherry的好处在于它的颜色和应用最多的绿色荧光蛋白（GFP）能进行共同标记，并且mCherry相对于其他单体荧光蛋白来说也具有卓越的光稳定型。m就是单体的意思。
mCherry的最大吸收/发射峰分别位于587nm和610nm，对光致漂白耐受，比较稳定易观察。mCherry具有较快的成熟速度，t0.5为15分钟，这在一些需要做出快速反应的实验非常重要，比如启动子活性报告系统等。
mCherry也是分N端和C端的。
下图是大部分可用的荧光蛋白相关信息
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荧光素酶
单/双荧光素酶报告基因原理
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件插入在荧光虫荧光素酶上下游，构成荧光素酶报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激后裂解细胞，测定酶的活性强度，通过荧光素酶活性的高低来判断刺激前后/不同刺激对转录调控元件的影响。
双荧光素酶报告基因是指萤火虫荧光素酶和海生荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从角虫中分离得到，分子量为61kDa;海肾荧光素则是从海肾中分离，分子量为36kDa。两者不同点在于底物，辅助因子不同和发光的颜色不同。
1. 底物和辅助因子不同：萤火虫荧光素酶(F-Luc)需要荧光素(luciferin)，氧气和ATP和镁离子同时才能发生，海肾荧光素酶(简称R-Luc)仅需要腔肠素和氧气。
2. 发光颜色不同：萤火虫荧光素酶产生光的颜色呈黄绿色，波长550-570nm；海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。
单荧光素报告实验受到实验条件的影响不能很准确的反映试验结果，双荧光素酶报告基因通过共转染的对照内参作为实验，尽力的避免了实验中细胞活性，裂解程度不同等实验误差。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，常常与萤火虫荧光素酶共转染细胞或者是将两个荧光素酶用不同的启动子构建在同一质粒上，计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值/海肾荧光素酶的检测值。
双荧光素酶报告基因实验流程
双荧光素酶报告基因应用
1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测荧光素活性。
3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。
检测NF-κB转录活性水平的荧光素酶报告基因质粒
pGL3-Basci基础质粒
海肾荧光素酶报告基因
基本上质粒图谱中常见的元件基本介绍完了，后面关于质粒会介绍一些常用的质粒及其元件组成，希望对大家有所帮助。
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