“会读质粒图才能用好质粒。”
前面部分稍微复杂一点的启动子和复制子已经大概介绍完了，后面会慢慢补充遗漏的小知识点，这一part是相对简单但是对于克隆筛选非常重要的----抗性基因。
抗性基因是一段已知功能或已知序列的DNA片段，起到特异性标记的功能。使细菌对氨基苄青霉素，氯霉素等抗生素产生抗性，利用此来判断基因表达载体是否成功导入细胞内。
pUC19 质粒图谱
pcDNA 3.1(+)质粒图谱
上面质粒图谱中圈出的AmpR，NeoR/KanR等表示质粒中抗性筛选标签，方便后面筛选出阳性克隆(重组成功的阳性质粒；自连的假阳性质粒需要后续质粒测序验证)。抗性基因可以参考用来区分质粒的种类，像复制起点一样，质粒中有两个复制起点一般为穿梭质粒；类似的质粒中有两种抗性基因一般为穿梭质粒(pcDNA3.1(+))。
抗生素可以买粉末选择合适浓度和溶剂自己配制，也可以购买现成抗生素按照说明书上比例稀释直接使用即可。注意为了保证长期保存，常需要过0.22μm滤膜，避光；分装；-20°C冷冻保存。
01
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原核抗性
下面是常用于原核生物的抗生素
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真核抗性
新霉素(Neomycin)/G418
新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，能够结合到细菌核糖体 30S 和 50S 亚单位引起 蛋白错误编码，在蛋白合成期间抑制起始和延长，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均 有效，尤其是对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌和炭疽杆菌作用更有效。与卡那霉素有完 全交叉抗药性，与链霉素有部分交叉抗药性。
新霉素的使用浓度跟细胞培养方式、细胞种类、载体 DNA 有关。悬浮培养细胞更敏感，使用浓度低，贴壁细胞使用浓度高。硫酸新霉素工作浓度 范围为 100~1000 µg/ml。
2. 嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride )
Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。
3. 潮霉素B(Hygromycin B)
Hygromycin B(潮霉素B)是来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的一种氨基糖苷类抗生素，对细菌，真菌和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。
Hygromycin B(潮霉素B)通过干扰蛋白翻译过程中70S和80S核糖体易位，诱导对mRNA模板的错误翻译而抑制细胞蛋白质的正常合成，从而导致细胞死亡。
大肠杆菌来源的Hygromycin B抗性基因(hyg或hph)所编码的Hygromycin B磷酸转移酶可将Hygromycin B磷酸化，导致其失去活性，从而起到解毒作用。因此，Hygromycin B可用于筛选成功转染了Hygromycin B抗性基因的原核或真核细胞。
4. 博莱霉素(Zeocin )
Zeocin即phleomycin D1，中文名称博来霉素或者腐草霉素D1，是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来的博来霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成员。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。
Zeocin是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈现蓝色，无活性。当其进入细胞后，Zeocin上的Cu2+被还原为一价铜离子(Cu+)，并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除，导致Zeocin被活化，能够结合到细胞内DNA上并使其断裂，最终导致细胞死亡。
上面是原核生物和真核细胞中常用到的筛选抗生素，可以根据实验需要寻找合适的抗生素，这一部分就先讲到这里。
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