期刊：《Frontiers in Microbiology》
影响因子：5.640
近日，派森诺生物与上海交通大学农业与生物学院合作，在微生物基因组领域《Frontiers in Microbiology》发表研究成果！本文首次报道一种新型假单胞菌1257菌株，该菌株可以有效抑制水稻黄单胞菌（xanthomonasoryzae，Xoc）在水稻中的生长和迁移，从而预防细菌性叶斑病(bacterial leaf streak，BLS)。
研究背景
假单胞菌是普遍存在于土壤、水、动物和植物根际的革兰氏阴性菌，其具有生长速度快并在植物根际持续存在的能力，能够产生广泛的次生代谢产物(如抗生素、铁载体、挥发物和促生长物质)从而适应环境胁迫，适合作为植物病原生物防治剂。假单胞菌属的某些种已被证明是有效的生物防治或生长促进剂，人们对该菌在商业和生物技术上的应用越来越感兴趣。
水稻黄单胞菌(Xoc)可通过侵染寄主水稻引起细菌性叶斑病(BLS)，该病已逐渐成为我国南方部分水稻产区第四大病害，严重时可导致减产10-30%。到目前为止，还没有发现对Xoc完全免疫的水稻品种。目前，我国普遍种植的水稻品种均对弓形虫敏感，甚至一些杂交水稻品种也是高度敏感的，目前我国常用杀菌剂如双美噻唑的使用，导致Xoc产生耐药性，因此，急需一种有效的、环境友好的生物防治方法。
本研究从223株候选菌株中鉴定了一株假单胞菌1257菌株，系统发育、基因组学和生理生化特征表明1257菌株是一种具有代表性的新型假单胞菌。此菌是首次报道的一种新型假单胞菌可能对BLS生物防治具有较大作用。
研究材料与方法
1、实验材料：上海市奉贤区庄航村古村采集的卷心菜根际土壤中分离得到的菌株1257；
2、测序平台：Illumina Miseq 、Pacbio
3、分析内容：细菌完成图测序、系统发育树构建、ANI分析、基因家族分析、共线性分析、次级代谢产物基因簇预测分析等。
研究结果
1、1257菌株分离和鉴定
在233株分离菌株中，发现其中一株1257菌株对Xoc RS105具有较强的抑制作用(抑制带> 40 mm)，另外8株Xoc分离自中国主要水稻产区(图1A)。扩增1257菌株的16S rRNA基因，将其与NCBI数据库进行比对发现1257菌株属于假单胞菌属，1257菌株的16S rRNA基因序列与P. entomophila L48(99.54%)和P. mosseliiCFMT90-83(99.48%)的序列相似度均超过99%。为了确定1257菌株的系统发育情况，对该菌株的全基因组进行了测序(图1B)。根据MLSA（MLSA分析使用的基因为10个管家基因，分别为16Sr RNA、aroE、dnaA、guaA、gyrB、mutL、ppsA、pyrC、recA和rpoB）分析结果显示，1257菌株位于一个单独的分支，其最接近的是P. entomophilaL48和P. mosselii型株CFMT90-83(图1C)。ANI分析发现，该菌株与已知菌种见的ANI值在73.77~89.13%之间，表明该菌株是一个新种。
图 1 |菌株 1257 的分离、鉴定和抗菌活性测定；（A）菌株 1257 的菌落形态和拮抗活性；(B) 菌株 1257完成图；(C) 菌株 1257 的基于 MLSA 的系统发育树。
2、1257菌株基因组特征和比较基因组分析
对菌株1257进行高通量测序，得到一条6,049,604bp的染色体，GC含量为63.76%，预测得到5,411个编码基因、22个rRNA、76个tRNA和73个其他ncRNA，该菌株的基因组和P. entomophilaL48的亲缘关系最近。从基因组大小上来看，菌株1257的基因组比P. entomophilaL48大，比P. mosseliiCFML90-83小。对这三个基因组进行共线性分析和基因家族分析：1.共线性分析发现菌株1257与P. entomophilaL48的亲缘关系最近；2.基因家族分析发现这三个菌株的核心基因组由11791个基因组成，占每个基因组的83.6 ~ 87.1%(图2C)，根据此分析发现菌株1257有957个基因家族是其特有的。
图2P. oryziphila1257 与其密切相关的两个假单胞菌物种的比较基因组学分析和抗菌表型。(A)拮抗实验； (B)共线性分析；(C)基因家族分析。
3、次级代谢产物基因簇分析
antiSMASH分析显示P. oryziphila1257的基因组包含8个编码二肽Nacetylglutaminylglutamine amidc (NAGGN)的候选基因簇、4个非核糖体肽合成酶(NRPS)和2个核糖体合成的抗微生物肽，芳基多烯(APE)型色素。Blast比对结果表明，在P. oryziphila、P. entomophila和P. mosselii基因组中，NAGGN、NRPS 3、APE和NRPS 4基因簇是保守的，而P. entomophila的次生代谢产物生物合成候选基因簇比P. oryziphila和P. mosselii多。
图3 次生代谢物生物合成基因簇比较。
4、Xoc抗菌机制的全基因组鉴定
Southern blot分析表明，所有突变体只携带一个转座子副本。将Tn5转座子插入到1257基因组13个不同区域的19个基因中，包括carAB、purMF、purCLDK、gntR-lgrD、sdhA、dsbB1、tuf1、serC、gph、dnaK、argG、sohB和rna2(图4A)。作者构建了carA、carB、purF和serC基因的完整功能片段，并将相关质粒导入相应的插入突变体中。结果发现，互补菌株对Xoc RS105的拮抗活性恢复到野生型水平(图4B)，表明这些基因在生物合成抗Xoc RS105活性化合物中起着关键作用。
图4 |全基因组鉴定P.oryziphila1257对Xoc RS105的抗菌功能基因。(A)P. oryziphila 1257的Tn5插入突变体特征。(B)野生型P. oryziphila1257、carA、carB、purF、serC和lgrD突变体及其互补菌株的抑菌活性测定。
为了明确上述功能基因所涉及的代谢过程，对其进行了KEGG注释分析。carA和carB基因编码氨基甲酰基磷酸酯合成酶，该酶催化氨基甲酰基磷酸酯(CP)的合成，是精氨酸和嘧啶代谢的前体。ArgG基因编码的ArgG是一种精氨酸琥珀酸合成酶，负责从天冬氨酸中产生精氨酸琥珀酸。sdhA基因编码琥珀酸脱氢酶a亚基，是三羧酸循环中的关键酶。这六个pur基因编码（PurF、PurD、PurL、PurM、PurC和PurK）是PPP中的代谢酶，将糖酵解途径(PP)中的核糖- 5p转化为5-羧基氨基-1-(5-磷酸- dribosyl)咪唑(CPR)。这些分析表明，CP和CPR可能是合成活性化合物的重要前体，也为进一步鉴定目标化合物提供了重要的依据。
图 5P. oryziphila1257抗菌活性相关基因的KEGG分析示意图。
5、稻瘟杆菌1257对细菌性叶斑病的生防效果
为研究水稻1257对Xoc RS105引起的BLS的生防效果，采用高感品种元丰早进行了田间试验:仅Xoc RS105(对照)，1257在Xoc RS105悬浮液(1257- tre)接种后12 h喷施，1257在Xoc RS105悬浮液(1257- pre)接种前12 h喷施。15天后调查BLS疾病严重程度：与对照处理相比，1257- tre和1257- pre预处理显著降低了稻田BLS的严重程度，相对防治效率分别为53.9%和39.7%。结果表明，1257-Tre处理具有较好的田间生物防治效果。
图6P. oryziphila1257对水稻BLS的生防效果。（A)P. oryziphila1257和Xoc RS105菌在15天田间试验中对水稻易感品种元丰早的病斑长度。(B)P. oryziphila1257和Xoc RS105接种元丰早在温室1、3、5和7天的病斑长度。(C)接种后1、3、5和7天，通过GUS定量检测和组织化学染色监测Xoc RS105-Gus在水稻叶片中的动态种群数量。
研究结论
1、鉴定了一种新的假单胞菌(P. oryziphila)1257菌株，它具有抑制Xoo和Xoc的能力，特别是抑制Xoc在水稻组织中的生长和迁移，从而预防BLS病；
2、基因组信息显示，该菌可能具有杀死昆虫、溶解磷酸盐、依赖T4P系统移动、降解IAA和PAA等功能基因，是一种万能菌；
3.在假单胞菌(P. oryziphila)1257菌株中发现一种非核糖体肽，该非核糖体肽可能是参与BLS生物防治的主要活性化合物；
综上所述，假单胞菌(P. oryziphila)1257菌株的发现为水稻细菌性病害的生物防治提供了新的微生物资源。
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