"DNA+RNA"-NGS准确检测融合基因并有效指导精准用药

  从上一篇文章中我们知道，检测融合基因的方法有很多，目前临床上检测融合基因的金标准仍然是FISH和IHC；基于NGS检测融合基因的方法也在不断完善，并逐步用于融合基因的临床检测中。

  基于NGS检测融合基因的方法主要分为两类^[1]：杂交捕获法和扩增子测序法，两类方法均可以从DNA和RNA水平检测融合基因；其中扩增子测序法可以进一步分为两小类：传统的多重PCR扩增法（mPCR）和锚定多重PCR扩增法(AMP)；其中杂交捕获法和锚定多重PCR扩增法(AMP)均能检测未知的融合伴侣基因。

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NGS检测融合基因现状

  目前，基于NGS的融合基因检测被广泛使用^[2]。FDA批准了多个基于新一代测序（NGS）的检测方法，例如FoundationOne CDx和MSK Solid Fusion，用于使用组织样本诊断基因融合。 最近，FDA批准了使用从血液样本中提取的DNA进行基因融合检测的“液体活检”NGS Assay，包括Guardant360 CDx和FoundationOne Liquid CDx。此外，用于融合基因检测的新NGS Assay即将上线，例如ArcherDX Assay，它使用锚定多重聚合酶链反应方法从血液和组织样本中富集DNA和RNA，并获得了FDA突破性设备称号。

DNA-NGS检测融合基因

  MSK-IMPACT第一个FDA批准的肿瘤NGS Panel（杂交捕获法），能够检测410个癌症相关基因的所有蛋白质编码突变，拷贝数变化（CNA）以及选定的启动子突变和结构重排^[3]。MSK-IMPACT检出了268例与激酶基因相关的融合基因，同时也能检测未知的融合伴侣基因。

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• DNA-NGS导致融合基因漏检

  然而多项研究表明，DNA-NGS Panel检测为融合基因阴性的样本通过RNA-NGS检测仍有5%~15%比例的样本为融合基因阳性^[4-5]。例如MSK-IMPACT检测为阴性的样本中有14.2%（36例）经MSK-Fusion检测为阳性，而且在接受靶向治疗的患者临床获益率是80%。

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• DNA-NGS检测的部分融合基因断点无法推测更具有功能意义的mRNA融合模式，不能有效指导临床用药

  DNA-NGS检测到融合基因中，融合伴侣有一部分来自于基因间区域。Yun等^[6]的研究表明：基于DNA-NGS检测到的13698个融合基因中，“基因-基因间区域”的融合占比为28%，“基因间区域-基因间区域”的融合占比为34%，“基因-基因”的融合占比仅为38%。临床上有大量关于肺癌中“基因-基因间区域”的病例报道，而且对相应靶向药物的治疗反应不一样。在关于NSCLC中ALK融合模式的综述中汇总了25例ALK与基因间区域发生融合的病例，仅有3例报道了对克唑替尼的治疗有响应。

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RNA-NGS检测融合基因

  McLeer-Florin等^[7]用RNA-NGS（mPCR技术）检测ALK融合基因并指导靶向用药，结果显示：基于RNA-NGS结果指导用药，ALK阳性患者的RS和PFS显著高于ALK阴性患者；而基于IHC的检测结果，不同分组的病人RS和PFS差异不显著；表明RNA-NGS相比传统方法能够提高ALK抑制剂的治疗有效性。

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• RNA-NGS能提高融合基因检出，提高患者接受靶向治疗的机会

  前面提到，DNA-NGS可能会导致融合基因假阴性，而RNA-NGS能够在假阴性的样本中进一步检测出真融合。对中国人群的研究同样显示，DNA-NGS检测为阴性的样本中，仍有10%的样本经RNA-NGS（AMP技术）检测为融合基因阳性^[5]；另一项研究^[8]中RNA-NGS（捕获+AMP技术）额外检出了2例DNA-NGS未检出的融合。

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"DNA+RNA" NGS准确检测融合基因并有效指导精准用药

DNA-NGS检测融合基因的迷思

  在DNA水平检测作为治疗靶点的融合基因会碰到以下几方面的困难^[9]：1）样本肿瘤细胞含量低，低于Assay检测灵敏度，从而导致漏检；2）由于内含子过长或者基因组经历复杂的重排事件等导致在Assay设计时无法覆盖足够的探针，从而导致漏检；3）当内含子中存在重复序列时，探针设计难度很高，生信分析时难度也很高，可能导致漏检；4）检出的罕见融合可能无法有效指导靶向用药。在RNA水平上检测融合基因能很大程度上规避以上不足；mRNA的形成过程中，长内含子、内含子的重复序列、复杂的基因组事件的影响会通过转录、剪切等过程消除；尽管样本量少，但相关融合基因的mRNA表达可能很高，因此RNA水平仍能检测；DNA水平的罕见融合只有在RNA水平也形成药物相关的靶点才能指导用药。

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• 内含子过长及或包含重复序列导致融合漏检

  Kurtis等^[10]使用多种方法检测ROS1基因的重排，发现4例样本经FISH和RNA-NGS检测为融合阳性，但DNA-NGS却检测为融合阴性，这种情况很可能是探针设置的缺陷导致的。进一步分析发现intron31因为存在重复序列，设计阶段就排除了探针覆盖该内含子完整区域的方案。如果融合断点所在的内含子区刚好被探针覆盖（部分或全部覆盖，A、C），那么融合就能被检出;有1例样本DNA-NGS检测为阴性，但RNA-NGS检测为阳性且与exon32相关，该融合断点很可能位于intron31未覆盖探针的区域。

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• DNA水平与RNA水平的融合不一致，导致指导用药效率低

  随着临床的深入，基于DNA-NGS检出非典型融合伴侣的报道越来越多，NSCLC中报道了25例ALK与基因间区域形成的融合，其中仅有3例对克唑替尼的治疗有响应^[11]，这提示我们DNA-NGS检出的罕见融合不一定能有效指导靶向用药。研究清楚罕见融合伴侣是否参与融合基因的转录和翻译过程并表达出有功能的融合蛋白，基因与基因间区域产生的融合基因是否能在RNA层面形成融合产物或者能否预测RNA层面的融合产物具有明显的临床实践意义，有助于精准的指导靶向用药。

  Li等^[12]的研究显示DNA-NGS检测到基因组上融合基因的断点信息无法有效预测RNA层面上的真实融合拼接方式，在DNA水平上表现为复杂或罕见的融合，相当比例在RNA层面上实质为经典的融合；DNA-NGS检测到的“基因-基因间区域”产生的融合有相当比例在RNA层面上并不产生功能性融合转录本；这些结果提示DNA-NGS检测的融合基因有部分无法作为靶向治疗的靶点，既无法从靶向治疗中获益，并会干扰医生的临床决策。

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"DNA+RNA" NGS检测融合基因的临床实践

  上面说到，针对融合基因检测DNA-NGS检测有很多不足之处，那么是不是只通过RNA-NGS检测融合基因就行呢？答案是否定的，没有一种检测的灵敏度和特异性能达到100%，RNA-NGS的设计和生信分析可能存在不足之处^[13]，DNA-NGS能弥补其不足。

  目前，为了解决DNA-NGS融合检测的局限性，国外临床实践策略主要有“并行检测”和“序贯检测”两种模式^[14]，但是实际操作层面上仍有诸多困难：“序贯检测”先DNA-NGS检测再RNA-NGS检测，不仅耗时，耽误及时治疗，还有可能因为样本量不足导致后续无法进行RNA-NGS检测；“并行检测”不仅增加了检测费用，同时也存在样本量不足的问题。

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参考资料：

1. Bruno, R. & Fontanini, G. Next Generation Sequencing for Gene Fusion Analysis in Lung Cancer: A Literature Review. Diagnostics 10, 521 (2020).
2. Song, Z., Lu, C., Xu, C.-W. & Zheng, Z. Noncanonical Gene Fusions Detected at the DNA Level Necessitate Orthogonal Diagnosis Methods Before Targeted Therapy. Journal of Thoracic Oncology 16, 344-348 (2021).
3. Zehir, A. et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nature Medicine 23, 703-713 (2017).
4. Benayed, R. et al. High Yield of RNA Sequencing for Targetable Kinase Fusions in Lung Adenocarcinomas with No Mitogenic Driver Alteration Detected by DNA Sequencing and Low Tumor Mutation Burden. Clin Cancer Res 25, 4712-4722 (2019).
5. Li, W. et al. Potential unreliability of uncommon ALK/ROS1/RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. Journal of Thoracic Oncology (2020).
6. Yun, J.W. et al. Dysregulation of cancer genes by recurrent intergenic fusions. Genome Biology 21, 166 (2020).
7. McLeer-Florin, A. et al. ALK fusion variants detection by targeted RNA-next generation sequencing and clinical responses to crizotinib in ALK-positive non-small cell lung cancer. Lung Cancer 116, 15-24 (2018).
8. Pan, Y. et al. Detection of Novel NRG1, EGFR, and MET Fusions in Lung Adenocarcinomas in the Chinese Population. J Thorac Oncol 14, 2003-2008 (2019).
9. Davies, K.D. & Aisner, D.L. Wake Up and Smell the Fusions: Single-Modality Molecular Testing Misses Drivers. Clin Cancer Res 25, 4586-4588 (2019).
10. Davies, K.D. et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. J Thorac Oncol 13, 1474-1482 (2018).
11. Ou, S.-H.I., Zhu, V.W. & Nagasaka, M. Catalog of 5’ Fusion Partners in ALK-positive NSCLC Circa 2020. JTO Clinical and Research Reports 1, 100015 (2020).
12. Li, W., Liu, Y., Li, W., Chen, L. & Ying, J. Intergenic Breakpoints Identified by DNA Sequencing Confound Targetable Kinase Fusion Detection in NSCLC. Journal of Thoracic Oncology 15, 1223-1231 (2020).
13. Heyer, E.E. et al. Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing. Nat Commun 10, 1388 (2019).
14. Cohen, D. et al. Optimizing Mutation and Fusion Detection in NSCLC by Sequential DNA and RNA Sequencing. Journal of Thoracic Oncology 15, 1000-1014 (2020).