前言
胞葬作用（吞噬细胞清除程序性死亡的细胞）对控制肿瘤生长一定是有利的吗？这可未必，最近刚发表在nature cancer上题为：Efferocytosis reprograms the tumor microenvironment to promote pancreatic cancer liver metastasis的文章，揭示了胞葬作用在促进胰腺导管癌（PDAC）肝转移过程中的作用，并发现通过药物阻断胞葬作用或者巨噬细胞特异性的颗粒蛋白前体耗竭会损害巨噬细胞向免疫抑制型转化，进而改善CD8+ T细胞功能，减少肝转移。
主要内容
1. 转移性肝脏中的巨噬细胞多种多样
首先，为了研究 PDAC 晚期转移灶的免疫学状态，作者从未经治疗的 PDAC 转移性患者中收集了新鲜的肝活检样本，并进行了bulk RNA-seq。结果说明转移性病灶是免疫沉默的，富含巨噬细胞和中性粒细胞，而T细胞、B细胞和自然杀伤细胞较少。
为了表征体内胰腺癌肝转移中的转移相关巨噬细胞（MAM）的异质性，作者分析了来自健康肝脏（2,428 个细胞）、早期转移灶（2,007 个细胞）、晚期近端转移灶（1,953 个细胞）和晚期远端转移灶（2,783 个细胞）的巨噬细胞，并进行了聚类和降维等分析。
图1：scRNA-seq聚类和降维分析以及marker基因分布情况
库普弗细胞 (KC) 和单核细胞来源的巨噬细胞 (MoM) 构成肝脏中的巨噬细胞群。簇0, 1, 4, 5, 6, 8和9显示了 KC标志物的高表达，例如Clec4f、Vsig4和Timd4。同时，簇2, 3和7高表达单核细胞来源的巨噬细胞标志物Ccr2。
在无肿瘤肝脏中，KC 亚群在巨噬细胞群体中占主导地位，尤其是占群体75% 的簇0。在有转移性病变的肝脏中，KC簇1, 4, 6和8以及所有三个MoM簇与无肿瘤肝脏相比均有增加，因此被鉴定为转移相关的巨噬细胞。
图2：不同肝脏状态下巨噬细胞分布情况
接下来，作者对MoM群体（簇2, 3和7）进行了额外的聚类和降维，并发现了6个不同的MoM簇。其中C簇与吞噬/凋亡细胞清除基因（Cd300a, Cd36, Scarb1, Anxa2和Gpnmb）相关，并富含溶酶体基因（Lipa, Ctsb, Ctsd, Psap和Grn）。CD74 −/low YM-1−（簇C）在早期转移性病灶中最丰富，而CD74 −/low YM-1+（簇A）代表晚期转移性病灶中最常见的MoM亚群。通过与CD8+T细胞的共培养实验，作者观察到晚期肿瘤的CD74 −/low的免疫抑制活性低于早期CD74 −/low。这可能归因于晚期CD74 −/low表达T细胞刺激因子（例如Il1a和Tnf）。总的来说，研究表明免疫抑制表型是MoM在转移早期获得的，并且与 CD74表达的丧失和胞葬作用相关基因的存在相关。
图3：MoM再次聚类和降维
2. 胞葬作用介导了免疫抑制型
为了探究胞葬作用与免疫抑制表型间的关系，首先作者推断，MoM中观察到的通路特征可能与转移引起的肝细胞损伤有关。并且在实验中证实，在PDAC肝转移早期，肝组织出现坏死，并出现了巨噬细胞的吞噬现象。早期的CD74-low巨噬细胞表现出免疫抑制活性，这与其表达的免疫抑制基因Arg1有关。研究还发现，使用Arg1抑制剂CB1158（ARGi）可以消除巨噬细胞的免疫抑制效应，这表明Arg1在调节早期和晚期CD74-low巨噬细胞的免疫抑制作用中起关键作用。
图4：ARGi处理消除了巨噬细胞的免疫抑制效应
接下来，作者使用了一种酪氨酸蛋白激酶Mer（MerTK）的抑制剂UNC2250（MerTKi）在体外阻断了胞葬作用。预期地，MerTKi减少了与凋亡胸腺细胞共培养的巨噬细胞的胞葬作用，并消除了巨噬细胞中Arg1表达的诱导。此外，MerTKi减少了具有胞葬作用的巨噬细胞的T细胞抑制活性。为了验证这些发现，作者通过在小鼠体内植入KPC细胞诱导肝转移，并连续7天给予MerTKi治疗。结果显示，在MerTKi治疗的小鼠中，早期转移病灶的肝组织坏死区域显著增加，表明由于胞葬作用受损而延迟了凋亡细胞的清除。MerTKi治疗并未影响早期转移病灶的肿瘤负荷，但在晚期阶段发现显著减少。
图5：MerTKi处理削弱了巨噬细胞的Arg1表达和T细胞抑制活性
3. 颗粒蛋白前体缺失可减少 PDAC 肝转移
由于阻碍坏死细胞的清除会导致组织损伤增加，所以干预胞葬作用的后期阶段可能是抑制PDAC肝转移过程中巨噬细胞极化的更好策略。作者分析了早期簇2 MoM中上调的溶酶体基因，并确定了颗粒蛋白前体（Grn）可能作为潜在的靶点。实验结果表明，颗粒蛋白前体在胞葬作用诱导的巨噬细胞转化中起到关键作用，其缺失可减少肝转移肿瘤负荷并降低巨噬细胞中Arg1的表达。此外，在巨噬细胞中缺乏颗粒蛋白前体也导致CD8+T细胞数量的显著增加，促进了免疫反应。
图6：Grn KO降低Arg1表达，增加CD8+T细胞
4. 颗粒蛋白前体缺失损害溶酶体酸化
颗粒蛋白前体缺陷型巨噬细胞（Grn KO）显示出被吞噬的凋亡细胞的积累增加，并且溶酶体中的货物保留增加的现象。这表明，颗粒蛋白前体缺陷型巨噬细胞摄取凋亡细胞，但溶酶体货物加工受损。进一步，作者根据之前有关颗粒蛋白前体通过影响溶酶体酸化来调节吞噬作用的报道，测量了WT型和Grn KO型在胞葬作用期间的溶酶体酸化。在WT型巨噬细胞中，溶酶体内的pH值迅速降低，溶酶体酸化增加，但在Grn KO型巨噬细胞中并未发现该现象。溶酶体降解后产生的脂质会被核固醇受体如：LXR所感知，且LXR之前被报道可以调控Arg1基因的表达。LXRi的药理学抑制消除了WT型巨噬细胞中Arg1的表达，但对Grn KO型巨噬细胞没有额外影响。此外，在WT型中LXR的活性要高于Grn KO型巨噬细胞。胞葬作用信号的受损与抗肿瘤I型干扰素免疫反应有关。作者发现，颗粒蛋白前体的耗竭显著增加I型干扰素反应的激活，这表现为核内IRF3水平的升高和Ifnb1表达的上调。
图7：Grn KO巨噬细胞摄取凋亡细胞，但溶酶体货物加工受损
5. 颗粒蛋白前体通过CFTR调节溶酶体酸化
作者进一步分析了与颗粒蛋白前体相互作用的潜在结合分子，并发现囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是其中之一。此外，作者还通过实验确定了颗粒蛋白前体与CFTR在WT型巨噬细胞的细胞质中共定位，缺乏颗粒蛋白前体会降低溶酶体中CFTR的水平，而CFTR的表达水平保持不变。使用 CFTRinh172（CFTRi）对CFTR的药理抑制会损害巨噬细胞中胞葬作用诱导的溶酶体酸化。此外，体外CFTR抑制显著降低了Arg1的表达，并消除了WT型巨噬细胞免疫抑制活性的增加，但对Grn KO型巨噬细胞没有任何影响。
图8：CFTRi降低Arg1表达，消除WT型巨噬细胞免疫抑制活性的增加
为了评估CFTR抑制对PDAC肝转移的影响，作者对KPC来源的癌细胞进行了脾内植入，并用CFTRi进行连续七天的治疗。结果表明，CFTR抑制可以显著降低晚期的肿瘤负担，降低早期转移肿瘤内MoM的Arg1表达水平，增加了CD8+T细胞浸润和激活（GzmB+ CD8+ ; CD69+ CD8+T细胞）。总之，颗粒蛋白前体通过CFTR调节巨噬细胞中的溶酶体酸化，并且使用CFTR抑制剂对溶酶体酸化进行药理阻断可抑制PDAC肝转移生长。
图9：CFTR抑制增加了CD8+T细胞浸润和激活
总结
总之，作者通过研究表明，PDAC发生肝转移的肿瘤细胞定植伴随着低度的组织损伤，从而引起巨噬细胞通过胞葬作用对死亡细胞进行清除，而这个过程会促进巨噬细胞功能重编程和进一步肝转移。此外，作者还通过实验证实干扰巨噬细的胞葬作用或其下游信号事件，可以抑制巨噬细胞的免疫抑制功能并恢复其抗肿瘤免疫。靶向巨噬细胞的胞葬作用可能是治疗转移性PDAC的一种新型潜在方案。
图10：干扰胞葬作用可以削弱巨噬细胞免疫抑制功能
sciclick有话说：
该研究从bulk RNA-seq起手，发现转移性病灶中是免疫信号被明显抑制。进一步通过scRNA-seq表征转移相关的巨噬细胞的异质性，层层递进筛选出单核细胞来源的巨噬细胞 (MoM)中的一个亚群，发现该亚群与吞噬/凋亡细胞清除基因相关，并富含溶酶体基因，因此推断胞葬作用与肝转移密切相关。接下来，作者通过干扰巨噬细胞的胞葬作用或其下游信号事件，证实了胞葬作用的受损会抑制巨噬细胞的免疫抑制功能并恢复其抗肿瘤免疫。总之，作者首先通过生信分析手段缩小搜索范围，确定细胞亚群和其marker基因的功能，进一步设计相关实验进行验证，是一个可以学习借鉴的干湿结合的典范。
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