接上一篇。
5.2.4 毕赤酵母生产GPCR的筛选
异源GPCR产物的筛选。
Boettner等人的高通量方法采用了24个深孔板上进行毕赤酵母培养。毕赤酵母克隆在5ml甘油复合物缓冲培养基(BMGY)中生长一夜，进行富集，然后在3ml甲醇复合物缓冲培养基(BMMY)中诱导。内含Erlenmeyer过滤器排气口的硅化橡胶帽，可以有效地进行气体交换，使细胞在53 h诱导过程中达到OD600≈25。为了使AOX1启动子得到最大程度的诱导，同时防止甲醇的积累，防止细胞毒性休克，在培养物中甲醇水平必须维持在一个狭窄的范围内。随后使用小的全细胞培养颗粒通过免疫印迹检测GPCR的生产。选择阳性克隆进行扩增。这种方法有可能推广到酿酒酵母。
5.2.5膜的放大和制备
确认毕赤酵母为阳性后。可以开始扩大的过程。这个程序也被直接用于筛选酵母转化子，尽管是在10-50毫升的范围内。扩大规模的目的是提高重组GPCR的产量，同时保持其生物活性。
5.2.5.1扩大
摇瓶规模培养通常是为了找到一个在可接受的水平生产具有生物活性的重组GPCR菌株或转化株。在此过程中，每条生长曲线都应与野生型进行比较。值得注意的是，增长最快的克隆不一定是最好的。在生长培养基中补充维生素和矿物质也可以提高生长速率和/或生物量产量。进一步补充其他成分，如特定配体、组氨酸和DMSO，也可能影响产生的蛋白质。DMSO可以改变膜双层的物理性质，也可以影响细胞内调节生化途径。然而，添加特定配体可能起到稳定GPCRs的作用。
应该在整个生长曲线上检查GPCR的产量和活性。对于酵母，方便的采样点是在高、中、低糖阶段和甲醇利用阶段，然后在甲醇诱导后的第12、24、48和54 h取样为宜。免疫印迹鉴定和活性测定应使用标准技术进行。从摇瓶到发酵罐/生物反应器的大规模生产也可以进一步提高产量。实验设计需要重点确定影响重组GPCR质量的变量。补料分批发酵是最常用的，因为它的简单和可重复性。特别重要的是溶解氧的含量。因为在高细胞密度下，这常常是一个速率限制因素。因此，使用富氧空气是有用的，以保持溶解氧水平在20%以上。
5.2.5.2膜的制备
通过过滤或离心来收集酵母细胞。接着是细胞裂解和膜组分分离。细胞裂解可以立即进行，也可以在液氮中快速冻结湿细胞(在薄层快速冷却)，并储存在-80摄氏度。可能需要不同数量的裂解，这取决于生长条件和细胞收获的生长阶段。因此，细胞应该在显微镜下观察，以确保裂解是有效的。
很多技术可以用于裂解酵母细胞，包括机械和非机械方式。机械破坏系统包括珠磨机、均质机和射流。非机械破坏可以是物理的(超声、热解、减压和渗透休克)，化学的(抗生素、超氧化物、螯合剂和溶剂)和酶的方法。我们首选的方法是机械裂解。
对于小样本(小于2ml)，使用玻璃珠快速准备FP120设备是非常有效的。这种方法的缺点是潜热的积累；因此，样品在运行期间必须在冰上冷却。如果没有FP120设备，那么可以使用涡流器和手工处理样品。
对于发酵后大量样品的裂解，恒定细胞裂解系统是非常方便的。可能需要对样品进行多次处理(通过在显微镜下观察细胞并评估细胞被裂解的百分比来确定)。然而，过多的通道可能会导致产生细微的细胞碎片，这些碎片可能很难从膜颗粒中分离出来。细胞碎片、可溶性蛋白和膜颗粒的分离分为两个步骤：低速离心降低细胞碎片(10000 g, 30 min)，高速离心上清(100 000g, 60 min)。膜部分悬浮，在液氮中快速冷冻，可以在-80C储存。如果需要，可以使用标准蔗糖梯度法进一步分离质膜。
5.2.6溶解和纯化
GPCRs的生产和最终结构和功能表征的一个重要步骤是在纯化之前能够有效地在去垢剂中溶解蛋白。选择正确的去垢剂是保证最大限度恢复具有生物活性、正确折叠的蛋白质的关键。去垢剂的纯度、在不同溶解浓度下保持蛋白质生物活性的能力、在所需工作温度下的溶解性、去除方法以及与下游纯化或结晶的需要之间的潜在冲突都需要考虑。一个关键参数是临界胶束浓度(CMC)，它被定义为洗涤单体聚集形成胶束的最低浓度。蛋白质通过疏水相互作用融入到这些胶束中。通常，有必要在CMC处或稍高于CMC处工作，因为胶束形成在一个狭窄的浓度范围内。
为了确定最佳的GPCR增溶去垢剂，需要评估一组不同浓度的去垢剂。用10种不同的去垢剂(从非离子到两性离子分子)进行增溶筛选是一个很好的起点。非离子型洗涤剂，如β-OG、DPC和LDAO通常比两性离子CYFOS-4和FC109更容易生成可溶性GPCRs。最近的研究已经确定了几种用于一般膜蛋白增溶的去垢剂和优化条件，其中包括：使用β-OGOG的SoPIP2;1，使用CYFOS的PagP barrel，使用DPC的SERCA和使用Brij-n的拟南芥叶膜蛋白。此外，蛋白质晶体学家们经常使用β-OG、LDAO、C8E4、DDM促进大量的晶体结构研究。
必须指出的是，对于选择哪种去垢剂并没有硬性规定，但研究表明，某些蛋白质在特定的去垢剂中确实溶解得更好。例如，White等人提出，在他们预测的跨膜结构域中疏水残基大于70%的膜蛋白，与疏水残基小于70%的蛋白相比，前者使用β-OG和C8E4更好地溶解。注意，还可以使用一种去垢剂进行有效地溶解，然后换成第二种更有利的去垢剂，用于下游蛋白质加工。
5.2.6.1蛋白质纯化
从酵母膜中成功溶解GPCR后，根据添加到蛋白上的标签，该蛋白现在可以使用亲和层析进行纯化。
固定化金属亲和层析(IMAC)是目前最常用的纯化方法之一。HisTrap HP预填充Ni-Sepharose柱(GE Healthcare)可以快速和高效的纯化，每毫升填料至少可以结合40 mg标签蛋白。这些柱子可以被清洗、去除Ni、重新挂Ni和重复使用，极具有成本效益。一般情况下，300mm NaCl与选择的最低浓度的去垢剂结合，可以很好地防止非特异性结合，以保持蛋白质的溶解和减少聚集。在样品中加入低浓度(约20-30 mm)的咪唑，对于进一步减少宿主细胞蛋白与纯化基质的结合非常重要。蛋白的洗脱最好采用增加咪唑的线性洗脱梯度，以获得高产量和高纯度。更多信息可在www.gehealthcare.com/hitrap上找到。
5.2.7重组蛋白分析
迄今为止，只有一种GPCR的X射线晶体数据，即牛视紫红质及其突变体的X射线晶体数据。电子显微镜也被用于研究天然膜中的视紫红质。此外，至少13种其它的GPCRs已通过非晶化方法进行了表征。下面将讨论各种蛋白质分析方法，重点介绍每种方法的基本原理和优缺点。关于所有技术的更详细的解释可以在许多可用的专门书籍和本书的其他章节中找到。特别是，生物检测在其他地方也有涉及，因为确定样品中活性GPCR的数量，以及最终将其纯化为均匀的、功能齐全的蛋白实在是太重要了。
5.2.7.1免疫印迹分析
一种标准技术。最敏感的检测方法使用化学发光开发的过氧化物标记二抗(允许检测<1 pg蛋白)。其他方法的近似灵敏度如下所示。
免疫印迹最常见问题是由于一抗和/或二抗与GPCR和/或其标记以外的蛋白质的非特异性相互作用而产生的假阳性。这通常是由于使用质量差的多克隆抗体造成的，通常可以通过使用高纯度的单克隆抗体和优化其稀释来克服。虽然这是一种有用的方法用于初步检测GPCR生产和大约大小估计，但它不能提供任何关于生物活性的信息，一般不能用于定量产量。
5.2.7.2圆二色性
CD光谱学依赖于色团对左右圆偏振光的吸收差。GPCR中最显著的发色团是多肽主链的酰胺基团，而GPCR的二级结构(a -螺旋和a -sheet)约束了CD跃进位置，导致单个远紫外(UV)光谱(180-240 nm)。近紫外区(260 - 320nm)的CD光谱来自氨基酸侧链，可以解释为蛋白质的三级结构。大多数传统的实验室CD分光光度计使用能够产生波长180-1000纳米的氙弧光源;然而，为了产生低于180纳米的光谱，必须使用真空紫外线或同步辐射源。
这种分析方法的主要优点是速度快，而且由于该技术的非破坏性，通常可以回收材料用于重复实验。仪器的发展也引发了停止流CD光谱学的发展，现在它可以记录在几十毫秒的时间尺度上发生的结构变化。
CD光谱学的主要缺点是获得的结构信息分辨率低。虽然它目前可以评估二级和三级结构水平，但它提供不了四级结构信息。此外，它必须与其他结构技术一起使用。推荐Kelly和Price对CD光谱学进行综述，文献中有GPCR肽分析的例子。
5.2.7.3线性二向色性
线性二色性(LD)光谱学的原理与CD光谱学相似，只是产生的信号来自于垂直和平行方向的线偏振辐射的吸收差。LD信号可以是正的(偏振平行于方向的跃迁)或负的(垂直于方向的跃迁)。远紫外区域的LD光谱可以生成关于蛋白质肽主链的信息，因此，通常可以用来验证CD获得的数据。此外，LD光谱可以显示GPCR是插入到膜内还是结合到表面。延长测量时间可以跟踪GPCR插入的动态。Dafforn等讨论了LD光谱在结构测定中的应用。
5.2.7.4分析超速离心法
AUC是一种通用技术，可用于表征大分子的溶液状态，包括去垢剂溶解的GPCRs。它可用于测定样品纯度、化学计量、甚至构象变化。由于样品在沉降过程中是实时可视化的，因此可以精确地确定动力学和热力学参数；由于实验是在溶液中进行的，所以不像凝胶过滤那样会因基质而产生复合物干扰。为了避免蛋白质电荷效应，通常建议最小的离子强度为50mM，并通过透析用适当的缓冲液对样品进行预平衡。
有两种类型的实验：
•首先，沉降速度技术对蛋白质的形状和质量都有响应。
•其次，沉降平衡是一种热力学技术，对蛋白质的质量敏感，但对其形状不敏感。
此类实验通常在较低的离心力下进行，并测量蛋白质的平衡浓度分布，该分布最终是由扩散平衡沉降而产生的，可以显示样品的低聚性。这两种测量都可以用来提供互补的数据。关于AUC有用的书籍有Cole和Hansen， Scott等人的和Schuster和Laue。
5.2.7.5傅里叶变换红外光谱
近年来，利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)来确定生物大分子的结构有所增加。虽然蛋白质在高分辨率下的完整三维结构可以通过X射线晶体学来确定，但这首先需要分子形成有序的晶体，特别是对于GPCRs而言，并不总能够形成这种有序结构。FTIR光谱常常需要少量的蛋白质(1mm)；因此，在低背景荧光、光散射和问题下，可以获得与蛋白质大小有关的高质量的光谱。
傅里叶变换是一种数学运算，用于将复杂曲线转换为其分量曲线。在傅里叶变换红外仪器中，复杂曲线为干涉图，即光波重叠所产生和破坏干涉的总和，组成曲线为红外光谱。标准红外光谱由傅里叶变换干涉图计算，得到透射率百分比(%T)相对于光频率(cm-1)的光谱。
FTIR通常可以提供比CD更敏感的sheet结构细节，并且有可能通过分子间sheet的形成来检测聚集。FTIR已被用于研究牛视紫红质的跨膜螺旋。
5.2.7.6核磁共振波谱
X射线晶体学的另一个替代是多维核磁共振(NMR)光谱学。利用核磁共振波谱，可以测定蛋白质在溶液中的结构。然而，对大蛋白的核磁共振谱的解释是非常复杂的，因此它的应用往往局限于大约15-25kDa的小蛋白。
关于核磁共振有用的书籍有Cavanagh等人的，Downing，Rule和Hitchens。
5.3 troubleshooting
虽然有时很费力和费时，但PCR扩增和克隆通常可以使用标准方法实现，出现问题也可以通过详细记录的故障排除步骤来解决。然而，到目前为止，最具挑战性的一步是获得一个有表达的克隆。根据我们的经验，一旦一个表达的克隆被识别出来，它就有可能被放大，重组蛋白就可以被溶解。接下来的挑战是获得稳定、均匀的功能蛋白样本。
使用针对特定标记的抗体(如His6、HA)检测重组GPCR，不一定保证该蛋白被正确折叠并插入质膜。在有限的情况下，使用针对GPCR特定拓扑区域的抗体是可能的，但这只有在抗体本身或时间和资源可用的情况下才有可能。假阳性克隆的检测可以限制不筛选全细胞提取物，而筛选膜组分。另一个可能遇到的问题是，膜蛋白在SDS-PAGE上的电泳迁移率通常与预期的不同。在某些情况下，无论是由于去垢剂不足还是由于蛋白质的性质，都有可能检测到二聚体、三聚体或多聚体结构和/或这些结构与单体的组合。为了克服这个问题，可以尝试增加变性时间和/或结合不同的SDS-PAGE凝胶百分比来调整变性温度。
生产一个稳定，功能重组GPCR涉及选择正确的纯化方案和并优化这个方案。现在，亲和层析，特别是IMAC，是首选的方法。在溶解和纯化的过程中，可以发生分离，然后GPCR失活。纯化后用特定的脂质重组GPCR可以重新激活它，但在许多情况下，活性无法恢复。解决这个问题的一个办法是在溶解和纯化过程中加入脂质到缓冲液中。在亲和纯化之后，可以使用凝胶色谱来确定GPCR是否均匀，这通常是结晶试验的先决条件。添加甘油、乙二醇或其他底物来模拟渗透压也可以考虑用来稳定蛋白质。所有这些考虑都必须注意，最有可能大量生产出适于结晶试验的GPCRs是最能从生物化学角度理解的;在理解目标GPCR生物化学方面的投资通常会在长期内得到回报。
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