重点来了~
5.1前言
天然状态下，GPCRs以低丰度存在于细胞膜中。因此，重组蛋白的生产是进行结构和功能分析的第一步。值得注意的例外是视紫红质，牛视网膜中可以分离出非常大量的视紫红质(>100毫克)，这一特性无疑对获得2.2 a分辨率的结构非常重要。有趣的是，也可以在哺乳动物细胞系COS中重组生成紫红质，最近有报道发现了恒温突变体的晶体结构。部分可能的原因是视紫红质与11-顺-视网膜结合时增强了基态稳定性。因此，其他通常不太稳定的GPCRs没有取得类似的成功也就不足为奇了。原则上，重组GPCRs可以在一系列宿主系统中生产，包括细菌、酵母、杆状病毒感染的昆虫细胞、病毒感染的哺乳动物细胞和无细胞系统。然而实际上，它们通常只在三种细胞中产生：酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。不幸的是，低表达水平、低效的纯化方案和无功能或不稳定的重组蛋白困扰着大多数模仿视紫红质的尝试。事实上，到目前为止，在结晶研究中以功能形式生产足够数量的GPCRs的例子很少。在这些情况下，首选宿主是毕赤酵母或哺乳动物细胞。很明显，最佳表达系统和最佳生产条件是不可预测的，必须由经验来确定。在这一章中，我们关注的是酵母，它有潜力生产稳定的，有功能的大量GPCRs。由于它是一种真核微生物，它结合了真核生物的成本以及类似于大肠杆菌的易于处理的速度优势。
5.2方法与手段
在考虑生产重组GPCR的方法和途径时，必须考虑对分子伴侣、糖基化或特定脂质(如固醇) 的需求。很明显，这些考虑势必影响所采用的分子生物学手段。其次，一旦达到了合适的生产水平，就必须保证蛋白质的功能、稳定和均一。举例而言，在 毕赤酵母中生产ɑ-opioid，经过优化的功能受体与非功能受体的比例从1:20提高到了1:4.5。
直观地说，最可能大量生产出适于结晶试验的GPCRs，是那些生物化学方面理解得最好的GPCRs。对于视紫红质，这当然是正确的，对于它，有丰富和详细的生化文献。此外，对人血清素和腺苷2a受体的仔细分析，无疑有助于理解如何在去垢剂中处理它们，以使其功能和稳定性最大化。
研究GPCRs的一个优点是在生产和纯化过程中可以通过配体结合分析手段进行功能表征。这对任何生产管线都很重要，因为纯化重组蛋白保持其固有特性是至关重要的。通过分光光度法测定二次结构的含量，也可以评价其对原有结构性质的保留程度。特别是膜蛋白的圆二色性(CD)光谱库正在建立中，它将成为一种越来越重要的资源。
本章内容包括选择合适的酵母品种，将编码目标GPCR的基因克隆成表达质粒，克隆选择，筛选，扩增，溶解，纯化，最后分析重组蛋白。
5.2.1酵母宿主的选择
目前已知的酵母有500多种，但只有少数几种被用于生产外源蛋白。最广泛使用的两种是毕赤酵母和酿酒酵母。
5.2.1.1 毕赤酵母
Invitrogen公司提供商品化的毕赤酵母表达系统试剂盒。这种甲基营养性酵母能够被培养到极高的细胞密度(例如，测量培养液的600纳米(OD600)光密度可达400以上)，这使其成为生产GPCRs的理想候选。该系统是利用启动子调节甲醇氧化酶(AOX1)的生产，操纵它来驱动整合外源蛋白的生产。毕赤酵母代谢甲醇的第一步是用醇氧化酶分子氧氧化甲醇，生成甲醛和过氧化氢。这一过程发生在过氧体内，以避免过氧化氢的毒性。由于醇氧化酶对氧的亲和力较差，毕赤酵母通过产生大量的甲醇氧化酶来弥补。
在甲醇培养的细胞中，大约5%的polyA + RNA来自AOX1基因。AOX1基因的调控包括抑制/去抑制机制，然后是类似于酿酒酵母GAL1基因的诱导。本质上，即使在甲醇存在的情况下培养毕赤酵母，葡萄糖上的pastoris也严重抑制AOX1的转录。因此，需要在含甘油的培养基中进行初始培养以解除对基因的抑制，并通过加入甲醇启动诱导。
所以，毕赤酵母的主要优点在于具有可获得很高生物量产量的能力，以及凭借强大的AOX1启动子在其细胞膜中产生大量GPCR的潜力。最近基因组序列的商业可用性也使得对这种酵母的基因操作更容易进行。
5.2.1.2酿酒酵母
酿酒酵母通常被称为面包师酵母，是一种重要的工业蛋白生产宿主。它作为最重要的真核生物模型的价值之一，怎么被强调都不过分：它的基因组已经被完全排序和注释，并且序列可以在网上免费获得。与毕赤酵母相反，酿酒酵母有大量可用的载体，如下表5.1所示。这些质粒包括整合质粒、自主单拷贝数质粒和自主多拷贝质粒。这意味着可以测试一系列不同强度的启动子，以优化最适合重组蛋白生产的机制。
5.2.2表达质粒的制备
通常，编码GPCR的DNA序列通过聚合酶链反应(PCR)从基因组DNA或cDNA扩增。然后将其克隆到适当的带有或不带有信号序列和/或融合标签的穿梭质粒或表达载体中，随后对序列进行验证。除非另有说明，以下所述的步骤同样适用于毕赤酵母或酿酒酵母。
5.2.2.1质粒的选择
表达载体必须包含优化的启动子、终止子和适当的核糖体结合位点。这些元件中的大多数早已被建立起来用于生产可溶性蛋白，这有助于选择和/或修饰合适的GPCR表达载体。
载体中可以含有任何可诱导的启动子，如毕赤酵母AOX1和酵母GAL1，或酵母TPI1等组成性启动子。有趣的是，没有广泛使用的组成型毕赤酵母启动子(表5.1)。所有载体的共同之处在于启动子的下游和终止序列的上游都有一个多克隆位点(MCS)，它由几个独特的限制性内切酶位点组成。例如，毕赤酵母的MCS，pastoris vector pPICZA包含以下位点：5-SfuI, EcoRI, PmlI, SfiI,BsmBI, Asp718I, KpnI, XhoI, SacII, NotI和ApaI-3。随后将基因克隆到一个或多个这些位点，将其转录置于上游AOX1启动子的直接控制之下。酶切位点的选择主要由GPCR基因的DNA序列决定，所选择的酶切位点一定不能出现在基因内。与此相关的是，在转化之前，该载体需要用SacI、PmeI或BstXI进行线性化，因此重要的是检查这些酶切位点，是否也存在于基因序列中。一旦选择了合适的酶切位点，它们通常会被植入用于扩增GPCR序列的PCR引物的5‘和第3’端，如下所述。
应特别注意确保编码的mRNA被有效地翻译。其中最关键的是起始密码子前基因的5‘未翻译区(UTR)。简而言之，5utr不应该包含以下任何一个:
•AUG密码子位于起始密码子之前，因为这会导致核糖体的错误引物和转录本的错误翻译;
•具有形成稳定分子内二级结构潜力的序列，因为这些类似茎的结构可导致显著的翻译抑制;
•含有鸟嘌呤核苷酸的序列，因为这些序列会降低翻译效率。
紧接起始密码子之前的序列是实现有效翻译的唯一最重要的特征。虽然许多真核生物的Kozak序列是已知的，一般认为运行至少五个腺嘌呤核苷酸之前AUG开始密码子是最低要求。然而，有研究表明，添加以下序列可以提高翻译效率，其中启动密码子以粗体突出:5-(A/U)A(A/C)AA(A/C)AUG。
5.2.2.2添加信号序列和标签
为了提高GPCR插入酵母细胞膜的机会，有必要通过酵母分泌途径引导蛋白质定位到膜上。为了实现这一点，氨基末端疏水信号肽必须被合并。用于此的最常见的信号肽形式是S.cerevisiae的配对因子(MF-alpha-1)的前pro区，这一方法可以将GPCRs的产量提高2 - 3倍。该肽含有22个氨基酸残基的“前”蛋白信号，连接到61个氨基酸残基的“前”区域。前蛋白信号被内质网膜相关的信号肽酶切割，而前区随后被高尔基体内的Kex蛋白酶切割。然而，Kex蛋白酶只识别和切割Lys-Arg连接，所以GPCR的氨基末端会与天然蛋白序列不同，多半会残留一个额外的残基。有几个载体包含MF的信号序列，包括pGS4和pPIC9K(表5.1)。还值得注意的是，在某些情况下，信号序列没有被裂解，导致GPCR与配体结合性能受损。
加入一个或多个融合标签也可能有利于后续的GPCR检测和/或纯化。到目前为止，最常用的标签是多组氨酸(如His6和His10)、Flag (DYKDDDDK)、HA (YPYDVPDYA)和c-myc (EQKLISEEDL)，它们都可以在氨基和/或羧基端。标签的定位最终取决于对末端是细胞内还是细胞外以及标签是否破坏GPCR功能的预测。没有建模或先前经验的帮助，最终的决定必须在实验之后作出。其他更大的融合标签，如绿色荧光蛋白(GFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)和谷胱甘肽- s -转移酶(GST)，也可用于提高产量水平，但通常需要去除它们以恢复蛋白质功能。
5.2.2.3 PCR扩增和克隆
一旦决定了要使用的载体和要添加的标签，通常将通过PCR进行克隆。PCR扩增手段已经非常成熟，因此，这里不详细介绍。相反，我们概述突出一些需要考虑的主要问题，并给出一个实验方法（后面会统一写一篇）。引物设计受到许多特征的影响，包括使用的限制性位点、是否包含5个Kozak序列，以及是否会编码小的氨基和/或羧基末端融合标签。利用一套引物，利用适当的Kozak和His6的羧基末端标记，可以通过PCR扩增GPCR序列。当然，扩增的GPCR序列也可以连接到已经包含适当序列和标签的载体中。这些决策将由手头的材料和用户的能力决定。
一般情况下，建议优化每个构建物的PCR条件;目前最简单的方法是温度梯度PCR，它可以同时测试12种不同的退火温度。如果这做不到，那么可以从互补区域引物的Tm值计算近似退火温度。推荐如下网址计算Tm值：www.premierbiosoft.com/netprimer。
PCR产物的纯化是提高克隆效率的一个重要步骤，这一步骤可以有效地去除所有微量的聚合酶，并在尽量减少扩增DNA损失的情况下更换缓冲液。目前市场上有一些现成的kit，例如Qiagen和Promega。一旦纯化，PCR产物就可以用标准技术一步消化并连接到适当的载体上。在进行酵母转化之前，必须对产生的表达质粒进行测序以确认插入基因的保真度。
5.2.3转化和菌株选择
通过在细菌宿主(如大肠杆菌XL1-Blue)中扩增，可获得足够的转化酵母细胞的优质质粒DNA。培养含有酵母表达载体的大肠杆菌克隆，以提供微克到毫克数量的质粒DNA。随后使用商业试剂盒(如QIAprep spin miniprep kit)裂解细菌细胞并从裂解液中纯化质粒DNA。
5.2.3.1 酿酒酵母转化
环状质粒DNA载体可通过乙酸锂转化和电穿孔等方法转化酵母细胞。通过在营养有限的培养基上生长来维持选择压力。LiOAc方法使用载体DNA(如超声鲑鱼精子DNA)来帮助获取载体。酿酒酵母细胞在复杂的培养基(例如酵母提取物-蛋白胨葡萄糖(YPD))中生长到对数期的中后期，然后在带有载体和载体DNA的平板溶液中孵育。孵育后，将细胞从转化混合液中取出，并在有选择压力的板上孵育，直到可以看到菌落。选择板的确切组成完全依赖于载体中可选择的标记。
5.2.3.2 毕赤酵母转化
线性化的质粒可以通过同源重组整合到AOX1位点。这就形成了一个完整的表达盒式，产生了一个表达菌株。AOX1中经常用于线性化的限制性内切酶是SacI、PmeI和BstXI。
当使用Invitrogen的表达载体(使用zeocin抗性标记)时，推荐的转化技术是电穿孔。
这就需要制备电敏感的细胞，通过使用缓冲溶液清洗中对数生长期的细胞来制备。这样可以去除在电穿孔过程中可能导致电弧的介质成分，如盐。许多制备感受态细胞的方案都是耗时的，需要多次清洗、离心和孵育。然而，有一种更少操作的浓缩方案，使用auxotrophic标记时效率相当，而在选择zeocin时效率大约低20倍。尽管如此，该方法仍然提供了足够的用于筛选多拷贝的转化子。电穿孔后，细胞易碎，需要小心处理。对转化子正式加压选择之前，需要一个“恢复”步骤。在富含营养的培养基中恢复使细胞有机会恢复细胞膜的完整性；酵母细胞需要至少45分钟的恢复时间。
如果选择的方法依赖于像zeocin这样的抗生素，那么拥有多个拷贝的克隆就可以被分离出来。通过在琼脂上增加zeocin的浓度可以实现：具有多个线性化质粒副本的克隆对抗生素的耐受性更强。这样的克隆可以使表达量增加2到3倍。
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