桓峰基因公众号推出转录组分析教程，有需要生信的老师可以联系我们！转录分析教程整理如下：
RNA 2. SCI文章中基于GEO的差异表达基因之 limma
RNA 3. SCI 文章中基于T CGA 差异表达基因之 DESeq2
RNA 4. SCI 文章中基于TCGA 差异表达之 edgeR
RNA 6. 差异基因表达之-- 火山图 (volcano)
RNA 7. SCI 文章中的基因表达——主成分分析 (PCA)
RNA 8. SCI文章中差异基因表达--热图 (heatmap)
RNA 12. SCI 文章中肿瘤免疫浸润计算方法之 CIBERSORT
RNA 14. SCI 文章中差异表达基因之 蛋白互作网络 (PPI)
RNA 15. SCI 文章中的融合基因之 FusionGDB2
RNA 17. SCI 文章中的筛选 Hub 基因 (Hub genes)
RNA 19. SCI 文章中无监督聚类法 （ConsensusClusterPlus）
RNA 20. SCI 文章中单样本免疫浸润分析 （ssGSEA）
RNA 22. SCI 文章中基于表达估计恶性肿瘤组织的基质细胞和免疫细胞(ESTIMATE)
RNA 23. SCI文章中表达基因模型的风险因子关联图(ggrisk)
RNA 24. SCI文章中基于TCGA的免疫浸润细胞分析 (TIMER)
RNA 25. SCI文章中估计组织浸润免疫细胞和基质细胞群的群体丰度(MCP-counter)
RNA 26. SCI文章中基于转录组数据的基因调控网络推断 (GENIE3)
RNA 27 SCI文章中转录因子结合motif富集到调控网络 (RcisTarget)
RNA 28 SCI 文章中基于RNA-seq数据反褶积揭示肿瘤免疫结构的分子和药理学 (quanTIseq)
简 介
早期的教程有分享过 TIMER 在线分析免疫浸润细胞，今天我们介绍一下升级版在线工具 TIMER2.0，功能更加全面。
TIMER是系统分析不同癌症类型的免疫浸润的综合资源。该版本webserver提供了多种免疫反褶积方法估计的免疫浸润丰度，允许用户动态生成高质量的数字，以全面探索肿瘤免疫、临床和基因组特征。TIMER2.0的估计分数可能与以前版本的定时器略有不同，因为在当前运行中用于批处理校正的可用 TCGA 样本数量不同。
TIMER2.0 同样也是利用RNA-Seq表达谱数据检测肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况。TIMER2.0 则提供28种免疫细胞的浸润情况：
TIMER2.0 有三个模块：
Immune Association
Cancer Exploration
Immune Estimation
Immune Association
免疫又包含基因（Gene）、突变（Mutation）、sCNA和结局（Outcome）四个项目，每个项目都会在最右边有相应的解释说明。
a. Gene
基因模块允许用户选择任何感兴趣的基因，并可视化其表达与不同癌症类型的免疫浸润水平的相关性。一旦你感兴趣的基因和免疫浸润物提交，一个带有数字的热图将显示各种癌症类型的纯度调整后的spearman's rho。点击热图上感兴趣的细胞，会弹出散点图，显示浸润估计值与基因表达之间的关系。肿瘤纯度是本分析的主要混杂因素，因为大多数免疫细胞类型与肿瘤纯度呈负相关。因此，我们建议用户选择“纯度调整”选项，该选项将使用部分斯皮尔曼相关性来执行该关联分析。特别是EPIC和quanTIseq这类方法，它们提供的是指总细胞的细胞分数，肿瘤纯度和免疫浸润必然呈负相关，因此使用EPIC和quanTIseq的估计值进行关联分析时不需要调整纯度。
我们以 TP53 在T cell CD8+为例进行查看：
该基因在HNSC，THYM 的 T cell CD8+免疫细胞显著表达，如下图：
b. Mutation
突变模块允许用户同时分析和可视化基因突变对多种癌症类型和免疫细胞类型的免疫细胞浸润的影响。用户可以手动输入基因名称，也可以从按突变频率排序的常见突变基因列表中选择。给定输入基因，TIMER2.0显示条形图，显示每种TCGA癌症类型的基因突变频率。当用户指定免疫细胞类型并单击提交时，TIMER2.0会显示输入基因突变的肿瘤与未输入基因突变的肿瘤之间免疫浸润水平的对数倍变化热图表。用户可以点击热图上的一个条目，查看突变型和野生型肿瘤中免疫浸润分布的小提琴图。
同样我们以TP53突变在T cell CD8+为例进行查看：
该基因在 LGG 的 T cell CD8+免疫细胞显著，如下图：
c. sCNA
sCNA模块允许用户通过基因的sCNA状态在TCGA癌症类型中比较免疫浸润分布。GISTIC2.0(25)从基因水平的拷贝数分割谱估计sCNA信息，包括“深度缺失”、“臂级缺失”、“二倍体/正常”、“臂级增益”和GISTIC2.0定义的“高扩增”。给定输入基因，TIMER2.0显示一个堆叠条形图，显示所有TCGA癌症类型的基因不同sCNA状态的相对比例。TIMER2.0要求用户指定基因的“深度缺失”或“高扩增”改变状态，以与“二倍体/正常”状态进行比较。当用户提交查询时，TIMER2.0会绘制一个热图表，显示指定的变化组与正常变化组之间免疫渗透水平的对数倍变化。点击表格中的条目，用户可以在小提琴图上看到该基因不同sCNA状态之间的免疫浸润分布，并将正常组与各改变组进行两两比较。
同样我们以TP53突变在T cell CD8+为例进行查看：
该基因在 BRCA 的 T cell CD8+免疫细胞显著，如下图：
d. Outcome
结果模块允许用户探索肿瘤免疫亚群的临床相关性，并在多变量Cox比例风险模型中灵活地校正多个协变量。协变量可以是临床因素或基因表达。一旦变量提交，TIMER将进行cox回归，如模型部分所示，然后在热图中显示跨多种癌症类型的每个模型的浸润归一化系数。应该注意的是，热图的每个单元对应一个独立的cox模型。我们不会在一个模型中包含多个渗透。点击细胞弹出的功能将显示相应免疫浸润和癌症类型的Kaplan-Meier曲线。渗透水平分为低和高水平，可以通过用户定义的滑块进行调整。Cox模型的风险比和p值，KM曲线的log-rank p值将显示在KM曲线图上。
同样我们以TP53突变在T cell CD8+为例进行查看：
该基因在 T cell CD8+免疫细胞风险模型，如下图：
2. Cancer Exploration
a.Gene_DEGene_DE模块允许用户研究所有TCGA肿瘤中任何感兴趣的基因在肿瘤和相邻正常组织之间的表达差异。基因表达水平的分布用箱形图显示。Wilcoxon检验计算的统计显著性用星数(*:p-value <0.05;**: p-value <0.01;***: p-value <0.001)。用户可以识别出每种癌症类型的肿瘤中与正常组织相比上调或下调的基因，当有正常数据时，灰色列中显示。
仍然以TP53为例进行查看：
b. Gene_Outcome
Gene_Outcome模块提供了各种癌症类型的基因表达的临床相关性。与结果模块一样，Gene_Surv使用Cox比例风险模型来评估基因表达的结果意义，可选地根据临床因素进行调整。将绘制热图来显示Cox模型中基因的归一化系数。热图细胞点击功能弹出，显示基因KM曲线。
仍然以TP53为例进行查看：
c. Gene_Mutation
Gene_Mutation模块比较不同突变状态之间的差异基因表达。你需要输入你感兴趣的基因突变和基因列表。一旦提交，热图显示每种癌症类型的每个基因差异表达的log2倍变化。单元格单击事件将为您提供一个弹出框图来显示详细信息.
仍然以TP53为例进行查看：
d. Gene_Corr
Gene_Corr模块用于探索您感兴趣的基因与各种癌症类型的基因列表之间的相关性。热图给你的纯度调整部分spearman的rho值作为他们的相关性程度。选择“纯度调整”复选框，如果您想调整关联。
3. Immune Estimation
该模块引用immunedeconv with TIMER, CIBERSORT, quanTIseq, xCell, MCP-counter(或鼠标的mMCP-counter)和EPIC方法进行估计，基本上包括现在在使用的免疫估计的所有软件，非常全面。
实际例子数据下载：
1. 5例TCGA LUAD肿瘤的表达谱文件
2. 所有TCGA肿瘤的浸润估计
3. 进入TIDE网站下载页面，下载所有TCGA肿瘤的TIDE估计
我们利用第一个例子进行展示，下载后的文件：exampleForLUAD.csv
结果如下：
注：所有模块下载都支持：table, jpg, pdf格式
参考：TIMER2.0 (comp-genomics.org)
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