10+SCI，生信分析筛选基因+实验验证，可以作为模板文章学习！

生信小课堂

大家好！今天给大家介绍一篇2023年1月发表在International Journal of Biological Sciences（IF=10.75）杂志上，题目为《 Validation of ESM1 Related to Ovarian Cancer and the Biological Function and Prognostic Significance 》，本篇文章结合生信分析和实验，从筛选到验证，得到了与OC的发生、发展密切相关的，有望成为OC新的生物标志物和治疗靶点——ESM1。

关于生信筛选基因结合实验验证，非常适合有实验条件的朋友。目前来说生信结合实验会比单纯简单的实验文章更好发，也是近些年10分上下实验文章的大趋势。肿瘤和非肿瘤均适合。欢迎交流！
摘要

背景：卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是一种严重的妇科恶性疾病，其早期诊断和治疗仍是一个巨大的挑战。基于R语言的GEO和TCGA数据库，使用生物信息学分析工具分别确认内皮细胞特异性分子1（ESM1）。ESM1已被证明在多种癌症类型中上调，但ESM1促进OC的致癌机制在很大程度上仍然未知。

方法：本研究采用WGCNA和随机生存森林变量筛选法筛选OC差异表达基因（DEGs）中的ESM1。接下来，通过PCR和IHC确认OC样品中ESM1的mRNA和蛋白水平。进一步证实了ESM1水平与OC患者的临床数据（包括FIGO分期、淋巴结转移和复发）之间的相关性。ESM1在OC的发展中的作用进行了探讨，在体内和体外的几个功能实验。通过生物信息学和实验分析，进一步阐明了ESM1的分子机制。

结果：ESM1在OC中显著上调，与PFS呈正相关，与OS呈负相关。在多个实验中，ESM1敲低抑制细胞增殖、凋亡逃逸、细胞周期、血管生成、迁移和侵袭。此外，GSVA发现ESM1与Akt通路相关，我们的结果支持这一预测。

结论：ESM1与OC的发生、发展密切相关，有望成为OC新的生物标志物和治疗靶点。

图 1 文章技术路线图

1. 1. 关键基因的确认

作者在GEO数据库收集了2组卵巢癌微阵列数据（GSE66957和GSE54388），得到了与OC患者相关的差异基因集（图2 A&B）；通过WGCNA确定了绿松石（GSE66957）和蓝色模块（GSE54388）为枢纽基因集（图2 G&H）；将枢纽基因集和差异基因集进行Venn分析，共得到326个关键基因，并对这些关键基因进行了GO和KEGG分析，并构建了PPI网络。

图 2通过差异基因分析和WGCNA鉴定关键基因

1. 2. 核心基因的鉴定和验证

通过随机生存森林算法，对关键基因进行特征选择，最终筛选出三个基因ESM1，CENPH和HIST1H2AE（图3A）；对这三个基因进行GSVA分析表明雌激素反应，E2F靶点是CERPH介导的主要途径。ESM1主要介导同种异体移植排斥反应和精子发生途径。UV响应dn和氧化磷酸化是HIST1H2AE表达的两种主要富集途径之一（图3C）；此外，Genemania网络还表明，这三个基因在多种生物学功能上具有密切的相互作用，包括核小体组装、染色质组装、核小体组织和蛋白质-DNA复合物组装（图3D）。

图 3 关键基因的验证

1. 3. OC免疫浸润和遗传改变相关核心基因

作者在TCGA数据库收集了379份OC癌症标本，并提取了ESM1，CENPH和HIST1H2AE核心基因的临床关联数据。结果表明，与病理1级OC组织相比，病理2级OC组织中ESM3的表达增加。然而，CENPH和HIST1H2AE的表达与OC的病理分级无显著相关性。为了阐明免疫微环境与三个基因之间的关系，作者基于TIMER数据库提取了三个基因的水平谱，该图谱表明了不同免疫细胞类型中的表达水平不同。此外，他们进一步分析了三个基因的水平与B细胞，CD8+T细胞，CD4+T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞浸润水平的关联。这些结果表明，这三个基因与OC患者的免疫浸润进展密切相关，特别是在HIST2H1AE和ESM1中。

为了确定OC的体细胞突变频率中是否存在三个基因，作者在cBioPortal数据库提取了Oncoprint谱CENPH、ESM1和HIST1H2AE的体细胞突变频率分别为6%、8%和17%（图4A），此外，为了显示免疫浸润与癌变之间存在显著的相关性，作者研究了这三个基因的TMB（肿瘤突变率），结果表明，在OC中ESM1高表达与更高的TMB相关( p = 6.343e-04 ) (图4B )。以上结果表明免疫检查点抑制剂对ESM1高表达的OC患者可能更有效、更敏感。

作者利用TIDE算法寻求免疫治疗的效率的可能性。除此之外，作者还评估了两种基因表达亚型（低或高表达水平）对三种化疗药物和两种EGFR-TK抑制剂的反应：顺铂、多西他赛、紫杉醇、吉非替尼和厄洛替尼。利用基于GDSC细胞系数据的岭回归预测模型。结果显示这五种药物的IC₅₀介于低和高水平ESM1之间，其中低ESM1可能对化疗（紫杉醇）和免疫学疗法（吉非替尼和厄洛替尼）更敏感。然而，在用五种药物治疗后，在CENPH和HIST1H 2AE中未观察到这种差异（图4C）。所以，具有高水平ESM1的OC患者是比EGFR-TK抑制剂（厄洛替尼和吉非替尼）和紫杉醇更好的免疫治疗候选者。基于TCGA数据库提取OC中这些核心基因的DNA甲基化谱，其显示与正常卵巢组织相比，OC中甲基化水平增加（图4D）。

图 4 三个关键基因的表观遗传修饰和遗传改变

4. ESM1的异位表达与OC的临床参数相关

作者首先使用TCGA和GEO数据库来确认OC患者中ESM1的表达，表明ESM1在OC中明显增强（图5A）。并收集了30对来自接受手术肺叶切除术的OC患者的邻近正常卵巢组织研究OC中核心基因的mRNA水平。qRT-PCR还显示，与相应的癌旁组织相比，OC中的ESM1显著增加（图5A）。基于TCGA数据库，作者还发现ESM1在OC诊断中具有高度的敏感性和特异性，这表明ESM1是OC患者的优良诊断标志物。此外，作者利用免疫组化染色来检测OC中的这些蛋白质水平。结果表明，与相应的癌旁组织和正常卵巢组织相比，ESM1的表达在OC组织中增加（图5B）。此外，作者还发现这些异位表达的蛋白与OC的一些临床参数密切相关，如FIGO分期、淋巴结转移和复发。提示ESM1可能在OC的发生发展中起重要作用。

图 5 ESM1在OC患者中的表达水平和预后价值

作者还基于KM-图数据库验证了ESM1在OC患者中的预后意义，其表明ESM1水平的总生存期（OS）与OS患者预后负相关（图5C），但ESM1水平的无进展生存期（PFS）与OS患者预后负相关（图5C）。与OC患者的预后正相关（图5D）。此外，作者还发现ESM1在早期OC患者中显著增加，这表明与ESM1 mRNA低表达的OC患者相比，ESM1 mRNA高表达的早期OC患者具有更好的临床治疗机会以获得更好的预后。作者使用TCGA数据库进一步分析了ESM1的预后价值。ESM1 mRNA表达与总生存率显著正相关，特别是在具有淋巴浸润、G3组织学分级、年龄>60岁和FIGO III期的OC患者中。与双侧OC患者相比，ESM1表达在单侧OC患者中也更高。在DSS和OS事件中，存活的OC患者具有比死亡事件的这些OC患者更高的ESM1 mRNA表达。最后，作者证实了ESM1在多种OC细胞系中的表达水平。qRT-PCR和蛋白质印迹显示，与正常卵巢细胞（HOSE）相比，OC细胞系中的ESM1 mRNA和蛋白质水平显著增加，尤其是在SKOV3和A2780细胞中（图5C&D）。

图 5 ESM1在OC患者中的表达水平和预后价值

1. 5. ESM1敲低对OC进展的影响

为了验证ESM1的病理生理功能，作者使用RNA干扰来抑制内源性ESM1表达。WB结果显示shRNA的最佳抑制效果是shRNA#1（图6A）。我们证实了ESM1对OC增殖的影响，这表明抑制ESM1可以显著降低体外增殖能力（图6B&C）。此外，作者还发现ESM1表达敲低显著抑制A2780和SK 0 V3细胞系中的DNA复制水平（图6D）。这些结果表明，ESM1基因敲低可显著抑制OC细胞的增殖能力。然后，作者通过流式细胞术证实了ESM1对A2780和SKOV3细胞凋亡水平的影响。结果显示，当ESM1缺陷时，两种OC细胞系中的凋亡水平明显增加（图6E）。此外，ESM1 KD明显诱导细胞周期停滞在Gl期（图6F）。

图 6 ESM1对OC增殖，细胞周期进程和细胞凋亡的影响

作者还检测了ESM1基因敲低对OC细胞迁移和侵袭的影响。OC迀移和侵袭被ESM1抑制明显减弱（图7A和B）。ESM1敲低后，抑制MMP9表达，但增强TIMP表达以抑制OC细胞迀移和侵袭（图7C）。

图 7 ESM1 KD可阻断OC迁移、侵袭和血管生成

1. 6. ESM1缺陷在体内和体外抑制OC血管生成

作者使用源自ESM1 KD或OE转染后的OC细胞的条件培养基（CM）孵育HUVEC 6小时，其用于进一步的管形成分析、增殖分析、迀移分析（图7D）。管形成分析显示，与NC和载体组相比，ESM1缺陷可诱导肿瘤新血管形成抑制（图7E和F）。

图 7 ESM1 KD可阻断OC迁移、侵袭和血管生成

伤口愈合测定显示，在ESM1 KD后，源自OC细胞的CM中HUVEC的迀移能力显著降低（图8A）。增殖试验还表明，与NC和载体组相比，具有源自ESM1 KD OC细胞的CM的HUVECS具有较低的增殖能力（图8B和C）。此外，CAM分析用于进一步证实ESM1在体内对OC血管生成的分子作用，与NC和Vector组相比，ESM1 KD具有明显降低的新血管形成密度（图8D）。在斑马鱼模型中也观察到ESM1抑制的作用，其显示ESM1 KD可显著抑制体内新血管的形成（图8E）。这些结果表明，ESM1基因敲减可以减弱OC细胞的血管生成能力。

图 8 ESM1敲低可在体外和体内抑制OC细胞血管生成

1. 7. ESM1抑制对体内肿瘤生长的影响

为了进一步证实ESM1在体内对OC的作用，将用载体或ESM1 KD转染的A2780细胞皮下注射到裸鼠中。我们发现ESM1抑制组中的肿瘤体积和重量明显小于载体组（图9A-C），这表明ESM1可以促进OC细胞体内的致瘤性。 IHC染色显示ESM1抑制可抑制VEGF-A、PCNA和Cdc 25 A的表达（图9D），表明ESM1可通过促进增殖、细胞周期和血管生成来加速OC进展。

图 9 ESM1抑制可以抑制体内OC细胞的生长

1. 8. EMS1敲低抑制人OC细胞中Akt/mTOR/ HIFα通路

根据GSVA结果（图3C），作者证实了ESM1对PI3 K/Akt途径的致癌遗传效应。蛋白质印迹分析显示ESM1抑制可使AKT途径失活并进一步降低Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、HIF-α、eNOS和MMP9的表达，这可被Akt活化剂（SC-79）逆转（图10A）。此外，我们通过ELISA检测了这些细胞组中的VEGF水平（图10B），这表明ESM1可以通过Akt途径增加VEGF的水平。总之，ESM1/Akt轴在OC细胞增殖和血管生成的调节中起关键作用（图10C）。

图 10 ESM1通过Akt/mTOR途径加速OC的发育和进展

1. 9. ESM1过表达（OE）通过Akt途径加速OC细胞的增殖、迁移和血管生成
      

此外，作者构建了过表达ESM1蛋白的CAOV3细胞系和用空载体转染的NC CAOV3细胞系。通过蛋白质印迹检测ESM1水平（图11A）。MTT分析显示ESM10E可显著增加CA0V3细胞的存活力（图11B）。EdU分析还显示ESM1可以加速CA0V3细胞中的DNA复制（图11C）。此外，我们发现ESM1可增强OC 迀移和侵袭能力（图11D和E），这明显增加MMP9但降低TIMP蛋白表达（图11F）。与NC相比，具有高水平ESM1的CAOV3细胞可诱导肿瘤新生血管抑制和载体组（图11G）。此外，ESM1的这些分子生物学效应可被Akt抑制剂LY 294002逆转（图11A-G），但ESM1表达不受Akt抑制剂LY 294002的影响（图11F）。此外，我们还发现ESM1可以增强用CA 0 V3的CM培养的HUVEC中新血管的形成，其可以被LY 294002挽救（图11 H）。进一步的实验表明，由ESM 10 E-CA 0 V3细胞分泌的高水平的ESM1可以增强HUVEC的增殖和迀移能力（图12 A-C）。CAM和斑马鱼模型分析用于进一步证实ESM1对体内OC血管生成的分子作用，与NC和Vector组相比，ESM1OE具有明显增加的新血管形成的密度和数量，而LY 294002显示出显著降低的微血管形成的密度和数量（图12 D和E）。这些结果表明ESM 1可以通过Akt途径促进OC进展。

图 11 ESM1过表达通过Akt途径对OC生物表型的影响

小结

本研究首次系统阐明了ESM1在OC进展中的表达、功能及其分子机制。并且证实了ESM1可以通过调节Akt/mTOR通路增加细胞增殖、凋亡逃逸、血管生成、迁移和侵袭。因此，ESM1可能是OC患者的诊断标志物和潜在的治疗靶点。本文利用公共数据库筛选关键靶点，并结合试验验证，层层递进，思路清晰，值得借鉴。