【现学现卖】数字PCR-digital PCR

作者: 番茄随笔 | 来源:发表于2020-07-10 04:48 被阅读0次

最近写的东西都是我做实验前了解的，就简单介绍给大家。今天，接着前两天的内容，讲一讲另一种定量PCR——绝对定量数字PCR。

链接是Bio Rad官网对droplet digital PCR（ddPCR）的详细介绍（关于实验原理，注意事项，结果分析等等，写的很详细和全面，我就不翻译了）。

https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf

虽然qPCR也可以绝对定量【现学现卖】实时荧光定量PCR——qPCR（2），但是需要借助标准曲线，首先，制作曲线前标准样品的制备可能导致结果没有很精确；其次，qPCR的定量是建立在指数型扩增的基础上，那么大于一定循环数的Ct值（平台期的）就不可信；还有，如果样品中目标基因拷贝数很低，不能被检测到。以上因素都会影响qPCR绝对定量的精确度。

于是乎有了新的技术——dPCR。如下图所示，dPCR（右）不同于传统PCR（左）的一点是，它的检测单元是成千上万的小液滴（nano-liter sized，纳升级液滴），传统的为一管。

其实dPCR样品溶液的组成和原理和qPCR的一样，都是用Tagman法。不过dPCR多了将溶液细分为小液滴的步骤，即微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

微滴化可以通过多种方法实现，比如常用的Bio-Rad的ddPCR通过油包水方法形成微滴；还有微孔板法、毛细管法等等。

我第一次听舍友说ddPCR的时候很是震惊，因为一个样品可以细分为20,000个小液滴，而且Bio-Rad手册上说这个数字非常准确和稳定。

她做实验的时候我跟着看，首先制备droplet微滴，装好三排孔板，在一个仪器上让油包住样品，形成两万个液滴。