抑制miRNA 功能的反义寡核苷酸制备

本方案用于设计特异性抑制细胞内miRNA 功能的反义寡核昔酸（ASO ) 。2′-O－ 甲基化修饰的反义寡核苷酸（ ASO ) 可以增加其有效性和抗降解能力， 然而3’端胆固醇修饰可以促进ASO 进入细胞内。

设备

连接互联网的计算机

方法

1 从miRBase ( http://rnicroma.sanger.ac. uk/sequences ) 下载目标miRNA 序列。

2. 根据Watson- Crick 碱基配对原则和miRNA 序列，设计反义miRNA 序列。

3. 在反义miRNA 两端加入5 个任意碱基（如5′-UCUUA－反义mRNA 序列－accuu-3 ‘ )，从而设计ASO 序列。

4 用mFold 默认设置(http ://mfold. bioinfo.rpi. edu/cgi-bin/ma-form 1-2.3 . cgi ) 检测ASO序列可能的二级结构。如果ASO 序列可以形成稳定的二级结构，则改变侧链序列并重复步骤4 。

5 进行Blast 分析 。如果mRNA 与侧链序列以及靶序列中13 个以上的碱基

互补，则重复步骤3 ～步骤5 。

6 设计对照寡核苷酸。所有的实验必须包含与实验组ASO 具有相同侧链序列和相同长度的错配序列 ( mismatched ) 对照和/或无关寡核苷酸对照。错配对照是指ASO 与目标miRNA 间至少存在4 个等距离的嘌呤－嘌呤错配。无关对照是指来自其他物种非同源的反义引物序列或随意序列组成的ASO 。如步骤4 和步骤5所述，所有对照寡核苷酸应仔细检查可能的二级结构及其与mRNA 的互补性。通过改变寡核苷酸序列的碱基可以尽量减少二级结构的存在及其与mRNA 的互补性。

7 从寡核苷酸合成公司获得2′-O－甲基修饰的ASO 序列。