影响因子：16.6
研究概述：肿瘤微环境的复杂性给癌症治疗带来了巨大挑战。在这项研究中，为了全面研究肿瘤-正常生态系统，作者结合了泛癌 137 空间转录组学、8887 TCGA 和 1261 个检查点抑制剂处理过的肿瘤，对来自 1070 个肿瘤样本和 493 个正常样本的 490 万个单细胞转录组进行了综合分析，定义了构成肿瘤-正常生态系统的多种细胞状态并构建了图谱。这份图谱描述了以 AKR1C1 或 WNT5A 为标志的炎性成纤维细胞在细胞相互作用和空间共定位模式方面的区别，发现了一个干扰素通路富集的细胞亚群，并通过泛癌免疫治疗队列与作者单位的肺癌免疫治疗队列验证了其对免疫治疗反应的预测能力。这项肿瘤-正常生态系统的系统分析加深了对肿瘤间和肿瘤内异质性的理解。
研究结果：
构建泛癌症肿瘤-正常单细胞meta图谱
图1 单细胞分辨率下的泛癌症肿瘤-正常图谱
为了对肿瘤和正常生态系统进行全面分析，作者构建了一个肿瘤-正常单细胞转录组图谱，涵盖了 30 种不同癌症类型的 104 个数据集，经过数据整理后，该图谱涵盖了来自 1070 个肿瘤和 493 个正常样本的 490 万个细胞（图 1A），其中乳腺癌（BRCA）是最多的癌症类型，其次是肺癌（LC），头颈癌（HNSC）和肝细胞癌（HCC），图1B-D是对细胞类型进行的初步注释。图1E是本研究涉及到的其他分析概览，作者先后对整合的数据集去除了双细胞等，最终的 UMAP 图展示了多个样本中反复出现的细胞状态的整体结构，同时得到了细胞状态特征（signature）用于将单细胞所得关联到bulk转录组的免疫治疗队列，并且将得到的图谱投射到新的单细胞数据集以及空间转录组数据集，证明了图谱的推广能力。
确定肿瘤-正常生态系统的通用标志基因特征
图2 各器官组织生态系统标志基因的分布情况
作者采用了一种 AND-gating算法系统地描述肿瘤中与正常组织相比反复失调的标志基因。对于 CD8+ T 细胞，共刺激分子（CD27）和免疫检查点或衰竭标志物如 CXCL13、PDCD1、TIGIT、CTLA4、LAG3 和 TNFRSF9 在肿瘤中普遍升高，而 IL7R、PTGER2 和 PTGER4 在正常组织中升高（图 2A，B）。肿瘤中的 Tregs 上调具有调控功能的基因，如 RBPJ、CXCR3 和 ZBED2，而正常组织中的 Tregs 上调 CCR7 和 CXCR5，表明免疫细胞招募和浸润的机制不同（图 2A，B）。GO分析表明，肿瘤浸润巨噬细胞、树突状细胞和 CD8+ T 细胞中上调的基因富集于相关的功能和通路，包括对病毒的防御反应、对 II 型干扰素的反应、炎症反应、淋巴细胞的趋化和细胞因子介导的信号通路（图 2C）。肿瘤细胞普遍表现出蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（PRKCA、GSK3B和CAMKK2）、糖酵解（PLOD1、EGLN3和P4HA1）、mTORC1信号转导（SLC2A1、GMPS和PDK1）以及与细胞周期过程正向调控相关的GO通路（E2F7、E2F8和KIF23；图2C）。癌症相关成纤维细胞（CAF）表达包括 FAP、COL1A1、COL10A1、MMP11 和 CTHRC1的公认标志物。肿瘤内皮细胞上调血管生成相关基因，包括 CHST1、FOLH1 和 MMP15。肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞都富集了与细胞外基质组织、细胞迁移调控、细胞-基质粘附等通路（图 2C）。
将肿瘤-正常生态系统去卷积为异质细胞状态
图3 将肿瘤-正常生态系统解构为异质细胞状态
随后作者解析了髓系细胞和间质细胞的不同状态（图3A,C），并相应地将其归属为能反映细胞状态的细胞类型（图3B,D），补充材料中包含了对上皮细胞，神经细胞等的状态和亚群划分结果。这些不同的细胞状态共同参与形成了复杂的肿瘤生态系统（图 3E, F）。例如，在肿瘤中，上皮细胞的 T 细胞排斥程序与 Treg 状态密切相关，促进了免疫逃逸和肿瘤进展。基底鳞状细胞状态与肿瘤组织中的炎症状态（如 CXCL9+ 巨噬细胞、LAMP3+ DC 和间质衍生干扰素状态）完全吻合，这表明基底鳞状细胞起源的癌症类型（HNSC 和皮肤鳞状细胞癌）具有触发免疫细胞浸润的内在特征。
AKR1C1 + 和 WNT5A + 炎症成纤维细胞作为不同亚型的表征
成纤维细胞是一个高度异质性的群体，具有胶原沉积、血管生成和细胞因子分泌等多种功能，在形成肿瘤微环境中发挥着核心作用，但在以往的泛癌症研究中尚未广泛探讨炎性成纤维细胞的多样性。在该研究的图谱中，作者发现了多种显示免疫相关基因表达的成纤维细胞亚型（图 4A），作者进一步关注到了 AKR1C1+ 和 WNT5A+ 表达的炎性成纤维细胞之间的区别，它们都与 PRR 诱导的活化状态相吻合，并具有相似的细胞因子基因表达（CXCL1/3/8，图 4A），而在标记基因（AKR1C1、FOSL1、LIF 和 THAP2 与 WNT5A、GREM1、TNC 和 MMP1）、组织来源（正常与肿瘤）和器官偏好方面存在明显差异（图 3E、4A、B），随后作者在不同癌症及其正常单细胞数据中进一步证实了这两种状态的存在（图4C）。
为了深入了解这些炎性成纤维细胞如何塑造 TME，作者进行了细胞通讯分析，以揭示 AKR1C1+ 和 WNT5A+ 炎性成纤维细胞与 BRCA、CRC、HNSC 和 OV 样本中其他细胞类型的独特相互作用（图 4D），发现WNT5A+ 炎性成纤维细胞会分泌多种配体，如 WNT5A、GREM1 和 IL24，在组织再生、炎症和癌症等多种情况下促进增殖、迁移和存活，它们与癌细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞成分相互作用，最终形成促肿瘤生成和核心炎症的 TME，随后作者使用多重免疫荧光定位和验证了 WNT5A+ 炎性成纤维细胞群的存在（图 4E）。为了进一步研究这两种炎性成纤维细胞的共定位模式，作者分析了多种癌症的空间转录组学数据，发现AKR1C1+ 炎性成纤维细胞与癌细胞、中性粒细胞、CTSK+ 巨噬细胞、DC1 和 PRR 诱导的 mo-DC 显著共定位（图 4F、G），而WNT5A+ 炎性成纤维细胞与去瘤纤维细胞、衰竭的 CD8+ T 细胞、Treg、DC1 和 PRR 诱导的 mo-DC 显著共定位，突显了其在形成免疫抑制性 TME 中的作用（图 4F、G）。总之，虽然两种炎性成纤维细胞都表达 CXCL1/3/8，但它们对器官/组织的偏好、细胞相互作用模式以及与其他细胞类型的空间亲缘关系各不相同，这表明它们在形成具有免疫侵袭性和致癌作用的 TME 中扮演着不同的角色。
肿瘤特异性干扰素富集和促肿瘤群落的重新排布
这一部分作者构建了一个细胞状态共现的无向网络，并在肿瘤、邻近正常组织和正常组织中发现了不同的网络群落（图 5A-C）。值得注意的是，一个肿瘤生态系统被肿瘤内各种细胞类型的干扰素状态明显占据（干扰素富集群落，图 5A），该群落还包含 TLS 的知名成分（LAMP3+ DC、CCL19+ 成纤维细胞和 Tfh）、特殊 DC 和巨噬细胞（DC1、pDC 和 CXCL9+ 巨噬细胞）以及抗原递呈机制状态。与此相反，干扰素丰富群体中的几种免疫细胞状态分散在健康正常网络中（图 5B）。有趣的是，在邻近的正常网络中，LAMP3+ DC 与干扰素丰富群落中的其他免疫细胞状态（DC1、pDC、朗格汉斯细胞和 Tfh）相邻（图 5C），这意味着与健康的正常组织相比，邻近的正常组织中甚至存在不同的细胞生态系统配置。
在确定了肿瘤、邻近正常组织和健康正常组织中富含干扰素和亲肿瘤性群落的多样性和动态之后，作者利用这些细胞状态的signature来解构泛癌免疫治疗队列中的bulk转录组数据（图5D）。二分类的meta分析支持了多种细胞状态对免疫治疗反应的预测能力，（图 5E），而具有显著预测能力的细胞状态大多是干扰素富集亚群的组成部分。
利用空间转录组学系统地研究多种癌症类型的肿瘤生态系统
为了研究肿瘤生态系统的空间组织，作者对 11 种不同癌症类型（n = 137，图 6A）的空间转录组学数据进行了系统分析。首先，作者利用了 RCC 空间转录组数据，，通过对TLS斑点和非TLS斑点进行差异表达分析，得到了一个能有效区分TLS斑点和非TLS斑点的TLS特征（图6B），这个TLS特征还可预测免疫治疗反应（图 6C）。此外，作者还利用 cell2location 对每个空间点的单细胞转录组图谱进行了解构，并比较了 TLS 点和非 TLS 点的细胞类型丰度，由此确定了在 TLS 中明显富集的细胞类型，包括 Treg、浆细胞、CD16+/XCL1+ NK 细胞、Tfh、LAMP3+ DC、CCL19+ 成纤维细胞和 ILC3（图 6D，E）。
总结
这项研究构建了一个广泛的图谱，将单细胞、空间和免疫疗法处理过的bulk转录组数据集结合起来，系统地比较不同器官的肿瘤和正常生态系统，从而得以揭示肿瘤-正常生态系统的标志性基因特征，勾勒出 AKR1C1+ 和 WNT5A+ 炎性成纤维细胞之间的区别，并描述了免疫疗法有利成分中 TLS 富集和非富集细胞类型的特征。研究中展示的泛癌症肿瘤-正常单细胞元图谱将为深入了解肿瘤-正常生态系统提供重要见解，并为未来的精准肿瘤学研究奠定基础。
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