肝转移是结直肠癌患者长期生存的主要障碍，这在一定程度上可以解释为癌细胞的高度动态扩散途径。在癌细胞外，肝转移的肿瘤微环境 （TME） 具有高度免疫抑制的表型，诱导抗原特异性 T 淋巴细胞的全身性丢失，并推动肿瘤扩散。但免疫细胞如何在空间上协调结直肠癌肝转移 （CRLM） 进展，以及转移性细胞微环境是否与原发性细胞微环境不同，目前仍不清晰。
2022年1月12日，复旦大学附属中山医院高强教授团队联合中国科学院上海巴斯德研究所张晓明教授团队在期刊Cancer Discovery上发表了题为 Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level 的文章，研究人员使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）对97个匹配的样本进行了测序，绘制出CRLM 的免疫图谱并揭示了新辅助化疗（NAC）治疗后免疫表型的变化特征，强调有效的NAC治疗对可切除CRLM患者的有利效果。
01 scRNA-seq 和 ST 鉴定可切除 CRLM 中的免疫细胞多样性
研究人员通过整合scRNA-seq和ST数据发现在未经处理的样本中，观察到与scRNA-seq一致的免疫细胞模式，例如CD8+T细胞在肝转移和结直肠癌中都显著富集。相比之下，在NAC处理的样本中，观察到较小的肿瘤区域和不规则的免疫细胞分布，特别是在肝转移中，只有一小部分Spot聚集成癌细胞，表明NAC治疗后细胞室发生了根本性的重塑。综上所述，这些结果突出了CRLM患者的时空动态免疫细胞图谱和NAC治疗后的巨大重塑。
02 转移性肿瘤富含免疫抑制细胞，尤其是MRC1+CCL18+M2型巨噬细胞
研究人员使用BCa bootstrap算法来估计免疫细胞比例，发现在肝转移患者中SPP1+巨噬细胞、MRC1+CCL18+巨噬细胞和中性粒细胞显著增加。同样，ST数据分析发现MRC1+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞也在初治肝转移中富集，这些数据与scRNA-seq数据基本一致，进一步证实了肝转移时潜在的抑制性TME。另外研究人员还探讨了癌症基因组图谱（TCGA）结直肠癌队列中 scRNA-seq 定义的免疫细胞亚群的预后价值：原发肿瘤中MRC1+CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞的高分均预示着更差的预后。这些观察结果也说明特定的巨噬细胞亚群可能在CRLM的前肿瘤生态位形成中发挥重要作用。
03 转移性肿瘤驱动巨噬细胞向抑制性状态转变
鉴于巨噬细胞亚群在肝转移中的富集，研究人员进行了基于受配体的癌症免疫串扰分析，并比较了原发和转移部位。研究发现SPP1+巨噬细胞和MRC1+ CCL18+巨噬细胞在肝转移和结直肠癌之间的所有差异串扰细胞类型中排名都靠前。这一结果表明，肝转移性癌细胞可能优先重编程巨噬细胞并诱导其特定的功能状态，这可能是由于原发和转移性癌细胞之间的内在差异造成的。
为了确定独特TME的差异，研究人员进行了结直肠癌和肝转移巨噬细胞之间的差异基因表达分析。研究发现富集在肝转移患者的MRC1+ CCL18+巨噬细胞高度表达巨噬细胞极化所必需的广谱关键分子，富集在结直肠癌中的MRC1+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞表现出更高的炎性细胞因子的表达，表明巨噬细胞从原发部位到转移部位具有共同的功能变化。
04 MRC1+CCL18+巨噬细胞在肝转移中的代谢活性急剧增加
代谢途径评分发现肝转移浸润的MRC1+CCL18+巨噬细胞在所有髓系细胞中表现出最高的代谢活性，这可能与它们在转移部位的独特功能有关。对MRC1+ CCL18+巨噬细胞所有代谢相关基因的无监督聚类确定了42条在结直肠癌和肝转移浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中可能上调的代谢途径。其中，苯丙氨酸代谢在肝转移富集的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中表达更高。差异表达的代谢基因分析发现代谢基因在原发性和转移性浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中特异性上调。同时，研究者还通过构建CRLM的小鼠模型进行了结果验证。
研究人员进一步分析了这42条肿瘤高代谢通路与MRC1+ CCL18+巨噬细胞表型评分的相关性。分析发现几种巨噬细胞特异性代谢途径，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，在肝转移中与抗原加工和呈递有很强的相关性，但在结直肠癌中则较弱。这些数据共同表明了代谢在确定MRC1+ CCL18+巨噬细胞表型中的潜在重要作用。
05 NAC反应性和非反应性肿瘤具有不同的免疫动力学，尤其是巨噬细胞
为了探索NAC对抗肿瘤免疫的影响，研究人员进行了CD45+细胞聚类注释，发现结直肠癌和肝转移之间的细胞聚类有很大的差异。NAC治疗后会下调反应性肿瘤的SPP1+巨噬细胞，但上调细胞毒性T细胞；然而病变进展/病变稳定（PD / SD）肿瘤呈现相反的免疫特征。结果表明，有效的NAC不仅可以重塑肿瘤内免疫平衡，而且还激活了全身抗肿瘤免疫反应，为NAC在可切除CRLM中的潜在应用提供了证据。
06 NAC诱导的巨噬细胞在反应性肿瘤中的代谢重编程
鉴于转移性肿瘤中MRC1+、CCL18+和SPP1+巨噬细胞数量有限，研究人员对未处理和NAC处理的样本之间的所有髓系细胞进行了通路富集分析，发现NAC诱导部分缓解（PR）组和PD/SD组髓系细胞的特异性功能变化：PR组肝转移巨噬细胞显示核糖体基因特征富集，而PD/SD组的显示与补体和凝血级联反应相关。NAC显著阻断了髓系代谢，PR组显示出更多的代谢下调。PD/SD和PR组巨噬细胞的糖酵解和糖异生始终下调；相比之下，PD/SD组的巨噬细胞还与特定的代谢途径有关，例如肌醇磷酸代谢上调。总之，NAC对髓系产生了特异性的代谢重编程，扩展了对NAC诱导的抗肿瘤机制的理解，并为可切除CRLM患者的潜在治疗方法提供信息。
07 多灶性转移的免疫微环境高度多样化
为探索转移灶免疫异质性，研究人员对四名多灶性肝转移患者所有CD45+细胞进行了无监督聚类。分析发现多灶性肝转移显示出不同的免疫特征。在未经处理的样本中，免疫抑制细胞在不同肝转移部位之间具有显著的差异性浸润，其中MRC1+ CCL18+巨噬细胞在P10肝转移中浸润较多。它们还具有明显的转移间表型/代谢活性，例如抗原加工和呈递。这种免疫微环境异质性可能导致肝转移患者对化疗和其他治疗的不同反应，这在临床实践中已经得到了充分的证明。
结论和意义
本文通过使用scRNA-seq和ST构建了CRLM的细胞和空间免疫图谱，并确定了新辅助化疗对TME的功能影响。免疫微环境在肝转移中经历了广泛的时空重塑和免疫抑制细胞的显著富集。特别是MRC1+CCL18+巨噬细胞表现出终末分化状态，展现出代谢激活表型，并且对新辅助化疗敏感。本研究不仅揭示了以前未被认识到的CRLM免疫生态系统的多样性，而且还为癌症研究提供了全面的资源。这些发现为癌症扩散的生物学提供了独特的见解，并提高了靶向转移代谢途径的可能性。
参考文献：
Wu Y, Yang S, Ma J, Chen Z, Song G, Rao D, Cheng Y, Huang S, Liu Y, Jiang S, Liu J, Huang X, Wang X, Qiu S, Xu J, Xi R, Bai F, Zhou J, Fan J, Zhang X, Gao Q. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):134-153. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0316. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34417225.
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