近日，Cancer Discovery 杂志在线发表了复旦大学及中科院巴斯德研究所关于结直肠癌肝转移的免疫动态变化的相关研究。该研究整合单细胞转录组测序和空间转录组学对 97 个匹配的样本进行了测序来描述结直肠癌肝转移（CRLM）的免疫进化，并揭示了肿瘤如何对新辅助化疗（NAC）做出反应。
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单细胞水平下结直肠癌肝转移的时空免疫动态变化
Spatiotemporal immune landscape of colorectal cancer liver metastasis at single-cell level
发表杂志：Cancer Discovery (IF: 39.397)
发表时间：2021年8月
应用技术：10x Genomics单细胞转录组测序，10x Genomics空间转录组测序
一、研究背景
肝转移是结直肠癌死亡的主要原因，表现出高度异质性和抑制性的免疫微环境。免疫细胞如何在空间上协调大肠癌肝转移（CRLM）的进展，转移性细胞微环境是否与原发细胞不同，目前仍不清楚。另外，新辅助化疗（NAC）是否有助于抗肿瘤反应和改善CRLM患者的预后尚不清楚。因此，揭示NAC的作用，特别是对肿瘤微环境改变的影响，对于理解NAC的关键机制和设计新的治疗策略至关重要。本研究对来自24例患者的97个样本进行单细胞转录组和空间转录组检测，旨在探索CRLM的免疫图谱。
二、主要结果
1. 单细胞转录组和空间转录组测序精确量化可切除CRLM中的免疫细胞多样性
共招募24例可切除CRLM患者，对结直肠癌（CRC）、邻近结肠、肝转移（LM）、邻近肝、结肠淋巴结（LN）和外周血单个核细胞（PBMC）样本进行单细胞转录组和空间转录组测序。其中20例患者的89个样本进行了单细胞转录组测序，4例患者的8个样本进行了空间转录组测序，其中13例患者的54份样本从未接受过治疗，6例患者的30份样本在NAC后出现部分缓解（PR），5例患者的13个样本病情稳定（SD）或出现进展（PD）。所有肿瘤均为微卫星稳定。
单细胞测序数据显示，获得未治疗患者（n = 11）样本79,703个细胞，NAC PD/SD患者（n = 5）样本36,284个细胞，NAC PR患者（n = 4）样本62,643个细胞进行后续分析。整合所有178,630个CD45+细胞，进行聚类分析，并使用SingleR和细胞Marker基因定义了主要的细胞类型。从CRLM样本中鉴定了骨髓细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK细胞和B细胞。值得注意的是，不同组织类型的T细胞比例明显不同，提示免疫微环境的组织异质性。CRC和配对LM均显示所有CD45+细胞中有10%左右的Treg细胞，而相邻正常组织中很少有这种细胞，这表明肿瘤内免疫受到抑制，可能由于肝转移免疫治疗效果降低导致。
获得2例未治疗患者和2例NAC PR患者的8个样本（配对CRC和LM）空间转录组数据。整合单细胞转录组和空间转录组数据，在未处理的样本中观察到与单细胞转录组数据一致的免疫细胞模式，如在LM和CRC中CD8+ T细胞显著富集。在NAC处理的样本中，观察到更小的肿瘤区域和不规则的免疫细胞分布。总之，两组学联合分析结果突出了CRLM患者的时空动态免疫细胞景观和NAC后的巨大重塑。
单细胞转录组和空间转录组学揭示了CRLM的免疫景观
2. 转移性肿瘤富含免疫抑制细胞，特别是MRC1+ CCL18+ M2-like巨噬细胞
结直肠癌相邻样本中AIM2+记忆B细胞、TCL1A+初始B细胞（naive B cells）、CD4+ Naïve T细胞（Naïve T cells）的比例最高，而结直肠癌样本中FOXP3+ Treg细胞富集最多。MAIT细胞、NK细胞和FGFBP2+ GZMB+ CD8+ T细胞在邻近的正常肝组织中富集。这些结果表明某些免疫细胞具有器官分布特异性。有趣的是，PDCD1+ CD4+ T细胞和CTLA4+ CD8+ T细胞分别富集在原发肿瘤和LMs中。这些细胞在TME中同时出现表明肿瘤对免疫细胞有共发生作用。LM中特异的存在免疫抑制细胞，其中SPP1+巨噬细胞和MRC1+ CCL18+巨噬细胞急剧增多，我们探索这些LM特异性巨噬细胞来源，发现尤其是MRC1+ CCL18+巨噬细胞，具有Kupffer细胞特征，表明它们可能来自肝脏Kupffer细胞。据报道，中性粒细胞具有潜在的促肿瘤作用，在LM中也富集。空间转录组数据分析结果也得到了以上一致的结论，进一步证实了TME在肝转移中的潜在抑制作用。
另外，本研究在另外三个独立的CRLM队列中验证以上结果，分别利用多重免疫组化（mIHC）、ssGSEA分析以及TCGA数据库验证的方法，结果表明CRLM的单细胞和空间转录组数据可以在独立队列中验证，表明了数据的稳健性，同时也揭示了特定的巨噬细胞亚群可能在CRLM的前肿瘤生态位形成中发挥重要作用。
从原发性肿瘤到肝转移的免疫重塑，特别是MRC1+ CCL18+巨噬细胞
3. 转移性肿瘤潜在的促使巨噬细胞转向抑制状态
本研究进行了基于配体-受体的癌症免疫串扰分析，并比较了原发部位和转移部位。值得注意的是，SPP1+巨噬细胞和MRC1+ CCL18+巨噬细胞在LM和CRC之间存在巨大差异，表明肝转移性癌细胞可能优先重编程巨噬细胞并诱导其特定的功能状态，这可能是由于原发和转移性癌细胞之间的内在差异造成的。值得注意的是，LM中的转移性肿瘤细胞优先表达配体CD47，这是一个重要的“don’t-eat-me”检查点，因此可能通过相应的受体SIRPA招募或激活MRC1+ CCL18+巨噬细胞。进一步利用mIHC可视化这些蛋白，并观察CD47+肿瘤细胞和SIRPA+巨噬细胞之间的串扰。这些在LM中特异性富集的配体-受体为靶向治疗肝转移提供了线索。
对CRC和LM巨噬细胞进行差异基因表达分析。LM富集的MRC1+ CCL18+巨噬细胞高表达了巨噬细胞极化的广泛关键，APOE 作为抗炎和pro-M2转化蛋白是显著差异表达基因之一，其他M2极化相关基因如MARCO也在LM富集的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中显著上调。相比之下，CRC富集的MRC1+ CCL18+巨噬细胞表现出更高的炎性细胞因子表达，包括TNF、IL1B、CCL3和CCL4，在SPP1+巨噬细胞中也可以观察到这种分子谱的变化，这表明巨噬细胞从原发部位到转移部位有共同的功能变化。通路富集分析显示， CRC和LM的MRC1+ CCL18+巨噬细胞的代谢通路都有很强的富集，强调了代谢在决定这些巨噬细胞功能中的基本作用。另外本研究发现CRC中MRC1+ CCL18+巨噬细胞富含氧化磷酸化，而LM中MRC1+ CCL18+巨噬细胞则以氨基酸代谢为主。这些数据表明，代谢调节可能介导巨噬细胞对不同微环境信号的表型和功能转变。
转移性肿瘤中MRC1+ CCL18+巨噬细胞表现为终末分化和抑制状态
4. scMetabolism可利用scRNA-seq数据量化代谢活动
由于在单细胞分辨率下挖掘细胞代谢活动仍然存在困难，该研究进一步开发了scMetabolism，这是一种用于量化单细胞代谢的计算方法。
5. MRC1+ CCL18+巨噬细胞在肝转移中的代谢活性急剧升高
为揭示CRLM中髓系细胞的代谢情况，本研究计算了抑制性巨噬细胞和单核细胞中所有76个活性代谢途径的得分，其中，LM浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞在所有骨髓细胞中表现出最高的代谢活性，这表明它们非常活跃，可能与它们在转移部位的独特功能有关。
进一步对MRC1+ CCL18+巨噬细胞所有代谢相关基因进行无监督聚类，发现其与周围组织较强的代谢偏好，确定了42个代谢通路在CRC和LM浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中可能上调。其中，有助于产生酪氨酸的苯丙氨酸代谢物在LM富集的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中表达较高。另外，本研究发现原发性和转移性MRC1+ CCL18+巨噬细胞中特异性上调的代谢基因，部分是已知药物的靶基因，使用mIHC验证这些代谢酶，并观察到基本一致的结果。
为了探究巨噬细胞的这种高度代谢激活状态是否在不同物种间保持不变，本研究构建了CRLM小鼠模型，并对原发/转移性肿瘤进行单细胞转录组测序。结果显示，LM中的巨噬细胞代谢活性急剧增加，例如苯丙氨酸代谢，抑制这种代谢活动可能会调动抗肿瘤免疫反应来控制晚期CRC的肝转移。为了说明代谢重编程与巨噬细胞表型变化的关联，本研究计算了巨噬细胞的经典通路评分，数据结果表明不同的代谢功能在MRC1+ CCL18+巨噬细胞表型中的潜在作用。
MRC1+ CCL18+巨噬细胞在转移性肿瘤中表现出高代谢活性
6. NAC应答性和非应答性肿瘤具有独特的免疫动力学，特别是巨噬细胞
为了探讨NAC对抗肿瘤免疫的影响，使用TooManyCells对所有CD45+细胞进行聚类分析，发现CRC和LM之间的细胞聚集有很强的差异。通过计算引导细胞比例并进行了差异分析来了解哪些细胞类型发生了变化，NAC对TME的影响具有高度的细胞类型特异性和背景依赖性。通常，在PR肿瘤中，NAC可下调肿瘤中的免疫抑制细胞并激活肿瘤中的毒性细胞，在LM中，应答性NAC下调SPP1+巨噬细胞，但上调细胞毒性T细胞，特别是NAC-PR肿瘤中只剩下几个MRC1+ CCL18+巨噬细胞和几十个SPP1+巨噬细胞，表明NAC可能在抑制巨噬细胞谱系中发挥作用。然而，在PD/SD肿瘤中，发现与PR肿瘤不同的免疫细胞变化，例如，LM中SPP1+巨噬细胞和MRC1+ CCL18+巨噬细胞水平升高，而细胞毒性免疫细胞（即FGFBP2+ GZMB+ CD8+ T细胞）下调。这些相反的结果可能与肿瘤细胞的器官特异性和治疗效果有关。总之，结果表明，有效的NAC不仅重编程了肿瘤内免疫平衡，而且还激活了全身抗肿瘤免疫应答，为NAC在可切除CRLM中的应用提供了证据。
新辅助化疗通过激活细胞毒性免疫细胞和抑制免疫抑制细胞来恢复转移性肿瘤的免疫平衡
7. 应答性肿瘤中新辅助化疗诱导的巨噬细胞代谢重编程
考虑到NAC主要影响髓系细胞，特别是巨噬细胞，因此本研究提出巨噬细胞的轨迹是否由NAC编辑的问题。根据接受NAC治疗的反应，对髓系细胞UMAP分布进行了分解，并在PD/SD和PR样本中发现了丰富的髓系表型。在未治疗的样本中，可以观察到髓样细胞的发展轨迹，而PR组的髓样细胞富集单核细胞表型，即巨噬细胞的祖细胞状态。进一步分析表明，NAC-PR肿瘤中巨噬细胞缺乏末端状态，如MRC1+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞明显下调，相比之下，NAC-PD/SD肿瘤中MRC1+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞水平显著升高。接下来，在另一个独立队列中使用mIHC检查这些巨噬细胞，证实了NAC-PR LM中MRC1+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞的浸润较低。使用dynverse进行轨迹推断分析进一步确定了从S100A9+单核细胞到MRC1+ CCL18+巨噬细胞的清晰发展轨迹，表明未治疗的细胞与NAC-PR细胞的具有相反结果。总之，结果表明化疗阻断巨噬细胞的运动轨迹仅发生在应答性肿瘤中。
鉴于转移性肿瘤中MRC1+ CCL18+和SPP1+巨噬细胞数量有限，本研究对未治疗和NAC样品之间的所有髓样细胞进行了通路富集分析，发现NAC在PR和PD/SD组诱导髓样细胞特异性功能改变。PR组的LM巨噬细胞显示核糖体基因标记的富集，PD/SD组与补体和凝血级联有关。利用scMetabolism分析代谢变化，显示NAC明显阻断髓系代谢，PR组代谢更明显下调，CRC和LM的PD/SD和PR组巨噬细胞的糖酵解和糖异生均持续下调，相比之下，PD/SD组巨噬细胞也与特定的代谢途径相关，总之，NAC发挥了特定的髓系代谢重编程，这可能扩展我们对NAC诱导的抗肿瘤机制的理解，并为可切除的CRLM患者提供潜在的治疗。
新辅助化疗样本中MRC1+ CCL18+巨噬细胞的代谢重编程
三、研究结论
本研究使用单细胞转录组测序和空间转录组学对97个匹配样本进行了测序。转移性微环境对MRC1+ CCL18+ M2-like巨噬细胞等免疫抑制细胞发生了显著的空间重编程。进一步开发了scMetabolism，一种量化单细胞代谢的分析策略，并观察到这些巨噬细胞的代谢活性增强，新辅助化疗可以阻断这种状态，恢复应答患者的抗肿瘤免疫平衡，而无反应性患者则恶化为更具抑制性的状态。本研究工作描述了转移的免疫进化，并揭示了肿瘤如何对新辅助化疗做出反应。
新辅助化疗时CRLM中促肿瘤生态位的独特动态示意图
参考文献
Wu Y, Yang S, Ma J, et al. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2021.
李超 | 文案
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