液滴型单细胞测序技术的比较

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单细胞测序方法和原理系列：

• 1. 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics
• 2. DNA文库构建和Illumina测序化学原理
• 3. 单细胞免疫组库：TCR基因重排原理和TCR测序建库方法
• 4. 单细胞ATAC-seq原理介绍与报告解读
• 5. CITE-seq：同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序
• 6. LIBRA-seq：快速开发单克隆抗体的单细胞技术

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一、单细胞测序技术的发展史

单细胞转录组技术简史

二、多种平台的比较

三、液滴型单细胞测序技术比较

基于液滴的方法包括15年背靠背发在cell上的Drop-seq和inDrop，还有17年发在NC上的10X Genomics Chromium。

Drop-Seq InDrop 10X Genomics Chromium

三种液滴型方法采用相似的技术生成液滴，采用barcode标记细胞，应用UMI进行偏好校正。但它们在beads的制造、barcode的设计、cDNA扩增等不同。
三种方法的比较2019年发在molecular cell上

总体差异

三种平台中，Drop-seq和inDrop的细节在15年的cell中描叙的非常详尽。而10X作为商用平台，技术细节未完全披露（整合了inDrop和Drop-seq）

三种技术的珠子上的序列大体类似，包含PCR handle, cell barcode, UMI和poly-T。inDrop的beads还带有photo-cleavable moiety和一个T7启动子。

但是10X和inDrop采用的是有弹性的水凝胶beads (hydrogel)，引物可以固定在beads里面，而Drop-seq使用的是聚苯乙烯固体磁珠，引物只能固定在beads表面。相较于Drop-seq体积较小的固体磁珠，inDrops与10x的胶体珠可以在微流控管道交汇处形变，能够耐受挤压，流速可控，最终可以达到几乎全部(98%)液滴含有规定数量的胶体珠（实现方差的超级小），在磁珠相打破了泊松分布(Sub-Poisson loading)，实现了超泊松分布（super-Poissonian distribution）（仅细胞相服从泊松分布），从而大大提高了细胞的捕获率。（参考：基于液滴的单细胞测序通量：泊松分布与次泊松分布）

10X is reported to have ~80% bead occupancy and a cell capture rate of ~50%.

包裹到液滴后，10X的beads发生溶解，引物释放到溶液中可以提高mRNA的捕获效率。inDrop使用紫外诱导的切割技术释放引物。而DropSeq的引物不能从beads释放，会降低其mRNA捕获效率。

此外，DropSeq和10X的反转录等过程都在液滴内进行，有利于提高效率和降低试剂消耗。inDrop采用体外转录方式进行扩增，需要时间比较久。关于cDNA扩增的方法，inDrop使用的是CEL-seq，10X和Drop-seq使用的则是类似于Smart-seq的template-switching protocol。参考单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics

结论

为了比较不同平台产生的数据，研究团队开发了可适用于三个分析平台的数据分析框架，方便数据比较。

结果显示：

1. 基因表达聚类与分析使用的平台有关，表明存在基因水平的系统特异性量化偏差。研究人员仔细分析了每个平台中偏差的来源，发现Chromium平台偏爱较短的序列和GC含量较高的序列，而Drop-seq对GC含量较低的基因检测效果较好。
2. 可捕获的细胞数目理论值：By rough estimation, the effective barcode size is ～5x10⁴ for inDrop and at least 1x10⁶ for Drop-seq and 3x10⁵ for 10X。

但是10X Genomics微珠的条形码错配较少，另外两个平台有超过一半的细胞条形码出现明显的错配。其中，Drop-seq约10%微珠的条形码出现一个碱基缺失。

3. 文库大小拐点法鉴定含有细胞的液滴，10X和inDrop拐点更明显

液滴型scRNA-seq方法中只有一小部分的液滴包含珠状物和一个完整细胞。然而生物实验不会那么理想，有些RNA会从死细胞或破损细胞中漏出来。所以没有完整细胞的液滴有可能捕获周围环境游离出的少量RNA并且走完测序环节出现在最终测序结果中。液滴大小、扩增效率和测序环节中的波动会导致“背景”和真实细胞最终获得的文库大小变化很大，使得区分哪些文库来源于背景哪些来源于真实细胞变得复杂。
大多数方法使用每个barcode对应的总分子数(如果是UMI)或总reads数的分布来寻找一个“break point”区分来自于真实细胞的较大的文库和来自于背景的较小的文库。
CellRanger假设真实细胞文库大小变化在10倍以内，用期望的细胞数目估计区间的分布。

4. 10X Genomics检测到的基因数目相对更多，有效Reads比例也最高

5. 就性能而言，10X Genomics的灵敏度最高，可在3000个基因中平均捕获17000个转录组；Drot-seq检测到2500个基因的8000个转录组；InDrop可检测到1250个基因的2700个转录组。灵敏度高的一个好处就是可以通过较少的reads获取相同级别的分子标记。此外，10X Genomics平台的噪音也最少。研究人员认为，inDrop平台噪音的一个来源是微珠的易变性，因为研究中出现了两批微珠检测同一样本的结果完全不同的情况。

液滴型单细胞测序平台各有优缺点，适用于不同应用。总体来说，10X Genomics的Chromium系统比Drop-seq或inDrop表现更强大，其技术噪音最小，稳定性最高。