总结

DESeq2的标准化步骤分为：1.计算标准化因子；2.计算dispersion；3.拟合dispersion曲线 ；4.shrink到曲线附近

计算标准化因子

首先是对我们的count矩阵进行标准化处理，每一列sample都对应一个标准化因子，每一列的每一个元素都除以该标准化因子，即完成了标准化
我们的count data：

首先我们计算标准化因子：

type <- factor(c(rep("control",2),c("treat",2)))

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(data, DataFrame(type), design= ~ type)
dds <- DESeq(dds)

dds.sizefactor <- estimateSizeFactors(dds)  
sizeFactors(dds.sizefactor )

我们可以看到，每一个sample对应的标准化因子，那么每一个sample对应的那一列count值分别除以该标准化因子后，即得到标准化后的矩阵

估计离散值（dispersion）

由于我们的数据每一个处理都有若干个生物学重复，那么我们需要考虑组内（相同处理内）的一个离散程度，这里定义为离散度dispersion
离散度的定义式：

其中 α 即为 dispersion，var为组内方差，μ为组内平均表达量
由上式可知，方差增加，离散增加；平均表达量增加，离散减少
那么如何求解 dispersion呢？

拟合dispersion

根据上面所述，我们分别求出每个基因在各个处理之中平均表达量与对应的dispersion之间的散点图，并通过极大似然法拟合出曲线。上图为某处理中某处理各基因的离散度与平均表达量的散点图

收缩

这一步收缩（shrink）是因为DESeq2认为具有相似表达水平（相似平均表达量）的基因应该具有相似的离散度。

因此离散在红色拟合曲线上下的基因需要收缩到红色拟合曲线附近，以保证具有相似表达水平（相似平均表达量）的基因应该具有相似的离散度。这样矫正之后，DESeq2才继续进行建模，来计算差异表达基因

可以利用DESeq2软件的 lfcShrink() 函数实现收缩（shrink），收缩后的log2FC可能更好看一些，并不受极端值的影响