edgeR文库标准化
编写DESeq2(和edgeR)的人意识到他们的工具将用于各种类型的数据集，所以他们希望他们的标准化去处理:
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问题1：调整文库大小的差异
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问题2:调整文库组成的差异：
第一步:去除所有未转录基因(去除所有样本中0 read计数的基因)
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第二步:选取一个样本作为参考样本(reference sample)
- 这是我们用来标准化所有其他样本的样本
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如何选择参考样本？为了避免找到极端的样本，edgeR会选择那些最“平均”的样本
- 按每个样本的总read数进行缩放
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- 对于每个样本，计算75%百分位数，等于或小于75%百分位数
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- 计算75%百分位数的平均值
- 那个样本的75%百分位数与平均值最接近就是参考样本(reference)
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第三步：计算标准化因子
我们将会从从参考样本和样本2选择基因集去计算样本2的标准化因子，从参考样本和样本选择基因集去计算样本3的标准化因子。不同的样本使用不同基因集去获得标准化因子。
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我们首先来看看可供选择的不同类型的基因。在参考样本中主要转录的基因、在样本2中主要转录的基因、在参考样本和样本2都大量转录的基因、在参考样本和样本2都很少转录的基因、中间的基因没有太多的偏向，在两个样本中都有适度数量的reads。edgeR选择中间的基因，花更多的努力去除偏倚基因（biased genes）。
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log fold differences
我们将会开始通过缩放的矩阵(每个基因的read count/ total)，接下来的几个步骤只有在有很多基因的情况下才有意义。edgeR通过观察logfold differences过滤掉偏倚基因（biased genes）。计算logfold differences：
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去除含有无穷值的基因，既然我们已经有了一个用来识别偏倚基因的对数比率表，那么让我们做一个表来识别两个样本中转录高和低的基因。
geometric mean
要确定两个样本中的高基因和低基因，首先计算每个基因的几何均值。几何均值不会轻易的被异常值影响。从技术上讲，我们没有计算几何平均值，因为我们没有将平均值转换回“正常数字区域”，但是效果是一样的——异常值对我们跟踪的值的影响较小。计算geometric mean:
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去除含有无穷值的基因，现在我们有两张表，一个去识别偏倚基因，通过log fold differences。一个去识别在两个样本都高表达和低表达的基因,通过geometric mean。我们对两个表格从低到高进行排序，对于左图过滤掉前30%和后30%的偏倚基因，对于右图过滤掉高转录基因和低转录基因的前5%和后5%。
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最终剩下的基因包含在省略号中，仍然在这两个表中的基因被用来计算标准化因子。
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第四步：计算剩余的log2比率的加权平均值
现在我们回到样本2，我们想象这些基因就是省略号中的基因(选择的基因集)，一旦你选择了哪些基因将用于计算标准化因子，只需计算它们的log比率的加权平均值。基因上的read数越多，它们的权重就越大。这是因为当read数较低时，log fold数值的变异程度比较大。
举个例子，基因1和基因3的read数相对较高，但差异为4。当有大量的read时，读取read的微小差异不会造成很大的log fold差异。基因4和基因6的read数相对较低，但差异为4。当有少量的read时，读取read的微小差异会造成很大的log fold差异。
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现在我们计算样本2和样本3的log fold的加权平均值，
加权平均值计算公式：
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第五步:将log2值的加权平均值转换为真值
计算样本2和样本3的标准化因子，计算公式：
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第六步：标准化因子围绕1居中
这是我计算的标准化因子的一个RNA-seq实验，以WT2为参考样本，下图中左边是原始标准化因子，这些值大致以0.95为中心，现在围绕1进行居中，最终得到右边居中过的标准化因子(centered scaling factors),我们对这批数据进行“中心化”，其实就是用它们的每个值除以这4个数据的几何均数，虽然居中不会改变结果，但是Mark Robinson说，经过中心化的处理就能赋予标准化因子一些数学上的美感。
几何平均数(geometric mean):
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