本次阅读的文献是今年发表在《cell》上的《Cell-Surface Proteomic Profiling in the Fly Brain Uncovers Wiring Regulators》，通讯作者是斯坦福大学的骆利群，以及开发这种技术的Alice Y. Ting。
对于多细胞动物来说，细胞间的通讯对于协调器官的生长和发育来说是必要的，特别是对于神经系统，神经递质受体和离子通道对于传递信号来说非常重要，因此理解和描述细胞表面信号对理解多细胞系统的组织原理和运行机制至关重要，这篇文章基于APEX的临近标记方法比较了幼年果蝇和成熟果蝇投射神经元细胞表面蛋白质组的差异。并且在幼虫中鉴定到20个全新的参与神经发育的因子。
首先他们将HRP(辣根过氧化酶)融合到跨膜蛋白CD2的N端，尽管HRP是在细胞表面定位，为了防止HRP在细胞的分泌途径中发挥功能生物素化其他蛋白，使用了一种膜不通透的生物素酚(BxxP)，这样就能够保证细胞表面的特异性。当存在过氧化氢的时候，发生的氧化还原反应能够使得生物素酚变成苯氧自由基，生物素可以共价连接到相邻的蛋白分子上，这样就可以通过过柱子打质谱鉴定到目标蛋白的相互作用蛋白了。
接下来他们利用果蝇的嗅觉神经元为模型，因为嗅觉投射神经元的树突通过其受体神经元的轴突相连传递信号，这样的区域称为触角叶，这样的模型的就对研究神经发育和成熟功能的区别非常有优势。于是他们在果蝇的PN外表达HRP了进行生物素化实验，在H202处理之后，用中性亲和素进行染色，发现其细胞外成分被特异的生物素化。然后如果进行生化的鉴定的话，使用链霉亲和素印迹和银染色均能够发现比对照组缺乏HRP-CD2的材料能够检测到更多的蛋白。并且可能特异性检测到定位在细胞表面的神经系统marker N-cadherin，而细胞内Actin BRP则检测不到。说明他们的系统能够去检测PN表面的蛋白。
嗅觉神经元表面蛋白
既然可用，于是他们分别想看看果蝇不同发育时期嗅觉投射神经元细胞表面蛋白质组的区别，于是他们就在甬36h和羽化5天后成虫，解刨脑部进行实验，他们每个样品解剖了1000的大脑，反应加入生物标记物反应，裂解富集，TMT标记。然后用液相质谱分析。其中他们每个发育时期有两组样品，其中每组有一个阴性对照，或是不表达HRP或是不用H2O2处理。然后他们一共拿到了2020个，为了去掉污染物，他们使用了TMT的比例，如果真的阳性的化，那么正常表达出来的目的蛋白应该表面多的多，分别选取了比例较高的蛋白，随后两次实验取交集，最后得到403个在发育时期的蛋白，561个在成熟时期特意表达的蛋白。通过韦恩图发现，其中在成熟和非成熟的组织中仅仅有252个蛋白存在重叠。还有一些蛋白是特异在不同发育时期起作用，通过GO分析发现成熟和未成熟特异表达基因虽然被预测均为细胞膜组分，但是可以看到他们分子功能产生了非常明显的差异，发现在发育的投射神经元表达的主要是和神经元发育相关的蛋白，但是在成熟之后可以看到很多现在没有鉴定到的蛋白，这些蛋白可能在投射神经元中发挥新的功能。
发育和成熟PNs的细胞表面蛋白组学分析
对这蛋白进行定量分析，看到看到随着发育时间的延长，神经元发育相关蛋白发育表达整体下调，以及突触传递相关的蛋白表达量整体上调。随后依据蛋白质功能进行聚类，发现不同功能主要按照发育时期聚在聚在了一起。此外他们还做了RNA-seq想看看，转录水平和蛋白水平的相关性，发现这些基因表达的整体趋势是一样的，但是相关性不是特别好，可能也暗示着mRNA水平其实是不能够准确反应发育过程蛋白表达的实际差异的。
细胞表面蛋白质组的时间进化与PN的发育和功能一致
此外由火山图可以发现与神经元发育相关的还有一些功能未知的蛋白，于是他们选取了差异表达较高这一段区域的功能未知的20个基因进行功能验证。正常触角叶其投射神经元的树突受体的轴突很好的定位在连接在一起，但是对其中一个LSP1γ进行RNA-i时，发现轴突树突的分布呈散装分布，对其进行染色，发现也不能保持原有神经纤维的结构特征，此外他们挑选的20个基因在RNAi之后全都出出现不同程度的缺陷，并且很多基因是不具备原先作为接线分子的结构特征的，并且其中有11个是和人同源的，暗示着这些基因功能的保守性。
LRP1细胞自主性控制PN树突的靶标
随后他们挑选了一个与人有同源基因的脂受体蛋白LRP1进行进一步研究，他们使用抗体染色发现，在触角叶形成后48个小时，LRP1能够被染色，这是恰好是PN树突与其受体轴突开始接线的时候，于是为了进一步确定LRP1的来源，于是他们使用了一种基于Crispr条件标记方法，简言之就是用这样一段序列去代替内源性LRP的终止子，如果不存在一个翻转酶FLP的话，其产物会带有一个V5tag，如果存在一个细胞特异的FLP，那么产物就会带有一个Flag 标记，于是用细胞特异的是FLP去尝试，可以看到ORN中表达FLP，未检测到flag信号，但是在PN中存在FLAG信号，说明LRP1是来源于PN的,随后在PN中特异knowdownLRP发现树突轴突之间存在局部的错配。此外还在PN中RNAi-LRP1导向其他类型的神经元时，发现出现了长距离错配的现象。说明LRP1能自主性去调控PN树突的靶标。
总而言之，这篇第一次在生物体内使用APEX这种方法去构建细胞表面蛋白组并且获得了极大的成功，但是对于其他不联系的组织，例如精卵细胞的信号交流这个一个问题，此外H2O2处理1min虽然很短，是否会引起下游一些不必要的信号通路激活，也是一个问题。
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