image.png image.png

文献学习 【要做笔记】
1.A comprehensive evaluation of normalization methods for illuminating high-thoughput RNA sequencing data analysis

2. Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data
3. survey of best practices for RNA-seq data analysis
4. hppRNA-a snakelike-based handy parameter-free pipeline for RNA-seq
   analysis of numerous samples
5. Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by
   performing a broad-spectrum RNA-seq analysis
   • RNA sequencing: the teenage years

转录组的最佳实践

1.实验设计 2.测序设计 3.质控
核心部分主要是：定量，差异表达分析，解释

更进一步就是联合 image.png

应用

• 差异表达基因
  Drug treated vs. untreated cell line
  Wild type versus knock out organism
• 发现新的转录本
• RNA编辑
• 可变剪接
• LncRNA鉴定
• 基因融合
• SNP Indel

分析策略

如何选择软件？如何选择参数【要找综述进行参考】! image.png

公司的pipline

image.png

实验流程图 image.png

1.为何要打断？【技术限制，只能测短的】
2.为啥要反转录生成cDNA呢？【RNA不够稳定】

image.png 文库：连接好接头的cDNA，叫做文库，英文为library image.png

index：一段特定的序列，标记不同来源的样本
6-8个碱基
read2测序引物结合位点：在Index序列的旁边GAT

文库质控

image.png
如何看图？【如果降解了就会被打断，5‘被打断了，5就变短了】 image.png

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------------------------------------分割线-------------------------------------------------------------------------------------------

SBS（Sequencing-By-Synthesis）：

通过单分子阵列实现在小型芯片（Flowcell）上进行桥式PCR
反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用
四种带有不同荧光标记的碱基，通过荧光激发/捕获，读取碱
基信息基于可逆终止的、荧光标记dNTP，边合成边测序

叠氮集团 image.png

双端测序（容易理解错）

DNA链，除了正向读一遍，还可以从DNA的负向读一遍
将DNA测序的有效长度加长了一倍
Forward strand：read1
Reverse Strand：read2，3'端引物

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目录管理

 示例如下：tree -L 1
├── biosoft #软件安装目录
├── database #数据库存放目录，包括参考基因组，注释文件，公共数据库等
├── pipline #流程搭建目录
├── project #项目分析目录
└── project_backup #数据备份目录

# 进入到个人目录
cd ~

## 1.建立数据库目录
mkdir database
# 在数据库下建立参考基因组数据库，注意命名习惯：数据库名字/物种名字/参考基因组版本信息
mkdir -p database/genome/Ensembl/Homo_sapiens/GRCh38_release95

## 2.建立软件安装目录
mkdir biosoft

## 3.建立项目分析目录
mkdir project
cd project
# 注意项目命名习惯：物种-样本数-疾病-分析流程
mkdir Human-16-Asthma-Trans
circRNA
sRNA
lncRNA
RRBS
tumorExome

## 4.建立数据备份目录
mkdir project_backup
# 哪天备份就在那个日期文件夹，非常有利于项目溯源
cd project_backup
mkdir 20200904
# 在project_backup下放一个所有备份数据路径的txt文件，方便快速查找项目
touch project_backup_all_220200904_update.xls
用vim 编辑，粘贴项目路径

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image.png

安装前记得激活小环境

# 每次运行前，激活创建的小环境rna
conda activate rna

cd software/
conda install -c hcc aspera-cli

判断安装成功
输入asc，按tab键补全ascp，

ascp -h #出来帮助文档

image.png image.png