农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程

植物分子研究

1. 农杆菌的培养及感受态的制备

① 农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；

② 挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min， 26-28℃悬浮培养12-16 h；

③ 将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；

④ 弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；

⑤ 4℃，8000 r/min, 离心8 min；

⑥ 弃上清，加入原始菌液1/50体积（800 l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100 l）的20 mM CaCl2重悬菌体；

⑦ 置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）

将感受态农杆菌置于冰上，加入1g质粒DNA（体积不宜超过10 l），充分混匀，冰上放置30 min；

② 置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；

③ 加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mll，留500 l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；

⑤ 重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；

⑥ 挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；

注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

注明：本方法整理自protocol网站，仅做分享。