电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵一抗 → 孵二抗 → 检测，剩下的就是等待。
图 1. Western blot 操作流程简介[1]
理想很丰满，现实很骨感，像在某宝买东西写差评：跟想象中不一样。顺便再晒几张“辣眼”买家秀以证现实的残酷。我的实验结果中出现了各种稀奇古怪的玩意儿？？？
■ 古怪一：高背景
萌 Cece 分析：
1、洗涤不充分，膜没有洗干净。
2、封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。
3、一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合。
措施：
1、对于洗涤不充分，可适当增加洗涤次数和时间，也可尝试提高洗涤液中 Tween-20 的含量 (如提高至 0.5-1%)。
2、要解决封闭不充分这个问题，可尝试延长封闭时间，也可更换封闭液。常用的封闭剂有
5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等，推荐室温封闭 1
小时以减少背景。另外，脱脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建议用 BSA 作为封闭剂。
3、如果一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合，洗涤也无法完全去除，建议设置多个抗体稀释梯度，从而筛选出合适的抗体比例。
■ 古怪二：斑点
萌 Cece 分析：
封闭液中出现了不溶性物质。
措施：
建议将封闭液充分溶解后进行过滤。
■ 古怪三：最头疼的，没有按照预期结果出现令人满意的条带，如：加入 p38抑制剂，但 p-p38 表达量没有变化。
萌 Cece 分析：
p38 虽然在不同的细胞中广泛表达，但是在没有诱导的情况下，表达量很低。
措施：
为了成功检测到 p38 的表达，建议：
1、使用阳性对照确保实验体系没有问题。
2、根据实验设计与需求使用诱导物 (如 LPS) 提高表达量。
图 2. LPS 处理前后 p38 表达量对比[2]
SB202190 是一种选择性的 p38 MAPK 抑制剂。SB202190 与 p38 激酶的 ATP 袋结合。
图 3. 在 LPS 诱导的情况下， SB202190 抑制 p38 磷酸化水平[3]
SB203580是一种 p38 MAPK 的选择性抑制剂。SB203580 抑制 p38 活性时，只抑制了由诱导剂 (如 LPS) 引起的 p-p38 增加量，但不改变 p-p38 的基础水平。这是由于 p38 的自身磷酸化，是不受 SB203580 影响的。
SB203580 通过降低下游 MAPKAPK2，HSP27 和 ATF2 磷酸化来调节 p38 MAPK 信号通路。SB203580 通过结合 ATP 结合区来抑制 p38 MAPK 的催化活性，但不能抑制上游激酶对 p38 MAPK 的磷酸化。
图 4. SB203580 作用机制[4]
So，找到了原因咱再来一次就离成功不远啦！阳光耀眼，乐观地，向前走！
除了以上建议外，萌 Cece 还有一些超实用法宝：
1、在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制剂 (HY-K0011，HY-K0010)。
2、检测磷酸化蛋白时，加入磷酸酶抑制剂 (HY-K0021，HY-K0022，HY-K0023)。
3、建议使用 RIPA 裂解液 (强) (HY-K1001)。
4、转膜结束后，使用丽春红染色确认转膜效果。
5、选用高灵敏度的 ECL 发光液, 特超敏 ECL 化学发光试剂盒 (HY-K1005)。
参考文献
1. Dae-Eun Jeong, et al. Western Blot Analysis of C. elegans Proteins. Methods Mol Biol. 2018; 1742: 213-225.
2.Weiju Wang, et al. Role of TLR4-p38 MAPK-Hsp27 signal pathway in LPS-induced pulmonary epithelial hyperpermeability. BMC Pulm Med. 2018 Nov 27; 18(1): 178.
3. Yong Li, et al. Mogroside V inhibits LPS-induced COX-2 expression/ROS production and overexpression of HO-1 by blocking phosphorylation of AKT1 in RAW264.7 cells. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2019 Apr 1;51(4):365-374.
4.Gopinathan Pillai Sreekanth, et al. SB203580 Modulates p38 MAPK Signaling and Dengue Virus-Induced Liver Injury by Reducing MAPKAPK2,HSP27, and ATF2 Phosphorylation. PLoS One. 2016 Feb 22; 11(2):e0149486.
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