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言归正传，我们还是回到今天的文章吧。
肿瘤免疫治疗和CRISPR/Cas9基因编辑技术自诞生就以来，便吸引无数人的目光。同为21世纪最为重要的生物发现之一，一个斩获2018年的诺贝尔生理学与医学奖，另一个则在2020年的比拼中获得诺贝尔化学奖。
肿瘤免疫治疗已成为晚期恶性肿瘤治疗的重要手段之一。与常规治疗不同，它并不直接攻击癌细胞，而是通过激活人体自身免疫系统来抗击肿瘤，具有良好的安全性及耐受性。PD-1/L1 抗体药物作为肿瘤免疫治疗的代表药物，在晚期恶性肿瘤治疗中取得巨大的成功。CRISPR/Cas9基因编辑技术一经诞生就被视为生物技术的明星产物，由于其稳定高效，已经成为科研界和工业界实现基因组编辑的强大工具。
近年来，CRISPR技术和免疫治疗的结合助力功能遗传免疫-肿瘤筛选的应用与发展，并在识别潜在肿瘤-免疫相互作用调节因子中展示出惊人能力，并产生大量的遗传免疫-肿瘤筛选数据。然而，很少有研究试图系统地收集和分析它们。因此，本研究对肿瘤免疫相关功能筛选数据进行全面的收集与整合，并利用大规模基因组数据集进行综合分析。
所以CRISPR技术和免疫治疗热点的强强联合，又将碰撞出什么样的火花，又将如何助力癌症治疗的发展呢？废话不多说，快来和小编一起开启今天的学习旅程吧。
Integrative analysis of CRISPR screening data uncovers new opportunities for optimizing cancer immunotherapy
CRISPR的综合分析开启癌症免疫治疗优化新篇章
1. CRISPR数据收集与整理
在本研究中，研究者共整理收集了17套针对免疫介导肿瘤治疗相关调控因子的CRISPR筛选以及5套免疫检查点封锁药物（ICB）处理的CRISPR筛选数据集合。肿瘤/免疫共培养系统的CRISPR筛选过程如图1A所示。研究者选择5种在免疫治疗研究中最常见的癌症类型作为研究对象，包括皮肤癌，乳腺癌和结肠癌等 (图1B)。大多数筛选是在体外条件下进行的(76.47%)，DrugZ(47.06%)和MAGeCK(35.29%)是CRISPR筛选数据分析中最常用的两种算法。
2. 抗肿瘤免疫相关调节因子的判定
基于以上CRISPR筛选数据，研究者通过sgRNAs丰度在免疫治疗和控制组的倍数变化识别出潜在的抗肿瘤免疫响应调控基因。敲除后对抗肿瘤免疫响应有积极作用，使相应的肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤产生抗性，富集其sgRNAs的基因被称为敏感基因，如与抗原呈递相关的基因。相反，敲除后促进肿瘤免疫逃逸，可以增强肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性，导致sgRNAs的耗竭的基因则被称为耐药基因，如CD274。基于以上假设判定每套数据中的免疫治疗相关敏感基因和耐药基因。然后将来自不同筛选的结果进行整合，只选择那些在两个或多个筛选中被识别到的基因进行进一步分析(图1C)。最终，获得181种免疫相关敏感基因和427个免疫相关耐药基因的初步清单。
考虑到筛选结果的准确性，为获得更可靠的候选调控因子，研究者通过三种已被证实的肿瘤免疫相关基因特征，包括免疫特征、细胞溶解活性(CYT)特征和MHC特征，进一步缩小该基因列表。首先根据TCGA pan-cancer的表达谱计算出这三个签名的相应分数，并基于多组学TCGA数据，包括表达、突变和拷贝数变异(CNV)等确定患者的基因功能状态是否失活。考虑到所有候选调控因子都来自于CRISPR敲除筛选的结果，研究者将功能丧失(失活)状态定义为主要功能事件。然后，基于回归的方法确定每个敏感/耐药基因的功能状态与每个特征的丰度之间的关联，在控制癌症类型和调整多重检验后保留有统计学意义的基因。三个特征的得分越高，表明抗肿瘤免疫反应越强。因此，根据敏感/耐药基因的定义，敏感基因与这些特征打分负相关(失活时得分较低)，而耐药基因应与这些特征正相关(失活时得分较高)。从结果可以看出，耐药基因呈现出正向关联比例较高的倾向。虽然不显著，但这在一定程度上可以证明该方法的合理性(图1D)。功能性敏感基因被定义为与所有三个特征打分具有显著负相关的基因(n= 65)，而功能耐药基因则被定义为具有显著正相关的基因 (n= 40)(图1E)。
图1. 基于免疫-肿瘤筛选数据的整合分析，识别参与抗肿瘤免疫应答的调控因子
3. 功能性敏感基因和耐药基因的功能分析
研究者进一步通过基于GO的功能相似性(FS)和注释分析来确定这些免疫治疗相关敏感基因和耐药基因的功能特征。105个基因的功能相似性打分如图2A所示。一般而言，与其他基因具有较高相似性的基因更有可能具有中心或更重要的作用。一些参与肿瘤免疫的关键转录因子基因，如STAT1和STAT2，与其他基因有较高的相似性。另外，通过敏感基因和耐药基因的比较表明，耐药基因具有更高的内部相似性。进一步的GO-BP富集分析结果表明，敏感基因更倾向于参与免疫相关过程，而耐药基因则主要参与一些代谢和生物合成过程(图2B)。
4.敏感基因和耐药基因的失调模式
研究者探索这些基因在不同癌症类型和免疫亚型中的异常表达模式。在肿瘤和正常组织中对这些基因进行差异表达分析。结果表明，两种基因在不同癌症类型间的差异不一致，敏感基因和耐药基因在不同癌症类型中的失活事件分布如图2C所示。
研究者进一步描述这些基因的功能状态与多类免疫亚型之间的关系(C1-C6)。为确定亚型特异性敏感基因和耐药基因，研究者采用logistic回归分析方法识别不同免疫亚型的特异性基因。最终识别出37个亚型特异性基因， 35个是敏感基因，包括2个C1特异性基因，10个C4特异性基因和25个C5特异性基因(图2D)。基于import的GO信息对这些基因进行注释，研究者观察到多个C5特异性基因的失活事件与抗原加工和呈递过程相关(图2E)。敏感基因和耐药基因在6种免疫亚型中的失活分布如图2F所示。
图2.敏感基因和耐药基因的总体特征
5.敏感基因和耐药基因在癌症中的功能表征
敏感基因(如B2M)的缺失应使肿瘤能够抵抗免疫攻击，而耐药基因(如CD274)的缺失则可能增强免疫细胞对肿瘤的细胞毒性作用。然而，这些基因的实际功能可能因癌症类型的不同而不同。为描述每种癌症类型中敏感基因和耐药基因的实际功能，研究者设计一种计算方法(图3A)。研究者首先手工整理除一系列具有抗/促肿瘤活性的免疫相关特征，包括免疫细胞、免疫检查点基因和炎性细胞因子等，并基于回归的方法计算敏感基因和耐药基因的功能状态（是否失活）与免疫相关特征丰度之间的关联。敏感相关(S相关)特征被定义为与敏感基因负相关的抗肿瘤特征(失活时活性较低)或与敏感基因正相关的促肿瘤特征(失活时活性较高)。耐药相关(R相关)特征则相反。因此，可以确定每种癌症类型中每个敏感/耐药基因的S / R相关特征的数量。从概念上讲，具有更大S / R相关特征数的敏感/耐药基因更可能在抗肿瘤免疫中发挥关键作用。研究者还分别计算敏感/耐药基因在不同癌症中的S / R相关特征总数(图3B, C)。B2M和TAP1等已知免疫调节因子，排名相对靠前。此外，研究者还发现耐药基因比敏感基因具有更多的相关特征(图3D)。
图3. 敏感基因和耐药基因在癌症中的功能表征
6. MON2是新的免疫肿瘤治疗靶点
为研究敏感基因和耐药基因的功能状态是否与癌症患者的生存结局相关，研究者对所有105个基因进行Cox比例风险回归分析。C2免疫亚型具有免疫炎症表型，因此在该亚型肿瘤中，癌细胞与细胞毒性免疫细胞之间可能存在更多的相互作用。因此，对于C2亚型，敏感基因和耐药基因的功能状态对预后的影响更可能是通过抗肿瘤免疫相关机制介导的。3个敏感基因和10个耐药基因与C2亚型预后显著相关(图4A)。此外，研究者在ICB治疗的数据集中探讨敏感基因和耐药基因与预后的相关性。研究者共收集来自8个不同研究的10套数据集，然后将其集成到一个元数据集。在这些数据中，敏感基因和耐药基因二分类功能状态的定义与TCGA数据相似。元数据组的生存分析识别出5个敏感基因和4个耐药基因(图4A)。有趣的是，可以观察到大多数敏感基因失活(75%)是不利的预后因素，而大多数耐药基因(93%)失活与良好的预后相关。
考虑到某些基因本身的缺失可能不是通过影响抗肿瘤免疫响应，而是直接影响癌细胞的生存,研究者进一步基于癌症基因依赖数据依赖图谱数据库(DepMap)对基因进行过滤。DepMap中提供一组包含739个癌细胞系基因被编辑后的平均CERES得分，研究者将CERES得分介于0.25到0.25之间的基因视为与肿瘤增殖无关基因 (图4B)。通过综合上述结果，耐药基因MON2被确定为唯一的独立增殖基因，它在TCGA C2和联合ICB治疗的数据中都与预后显著相关(图4C)。
7. MON2与抗肿瘤免疫的关系
研究者系统分析MON2在抗肿瘤免疫中的作用。MON2被17个CRISPR筛选中的两套数据确定为重要的耐药相关基因。鉴于其中一项筛选是在小鼠乳腺癌细胞中进行的，研究者在两种人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中进一步验证该发现。通过CRISPR/Cas9生成MON2缺失的肿瘤细胞，并与可以识别抗原- MHC I类复合物的TCR转导的T细胞共培养。研究者观察到，MDA-MB-231和MCF7细胞中MON2缺失的细胞比MON2丰富的细胞对T细胞的杀伤作用更敏感，这与小鼠细胞中CRISPR筛选的结果一致(图4D, E)。此外，在多个ICB用药数据集中，MON2的缺失与ICB响应相关 (图4F)。并且，MON2表达与抗PD-L1/PD-L1治疗的客观缓解率(ORR)之间存在微显著负相关(P= 0.093)，在一定程度上进一步印证上述结论(图4G)。因此，抑制MON2可能导致抗肿瘤免疫增强，这可能为治疗具有高MON2活性的肿瘤开辟新的可能性。
图4. MON2与抗肿瘤免疫
8.构建CTIS预测免疫治疗响应
以上研究结果表明敏感基因和耐药基因在免疫细胞介导的肿瘤杀伤中发挥重要作用，研究者进一步基于这些基因构建一个能够预测免疫治疗响应的特征方法。图5A为特征构建的详细过程。首先研究者进行初步筛选，排除S / R相关特征小于100的基因(在所有癌症类型中)，过滤后得到39个敏感基因和37个耐药基因。在预处理样本量最大数据集的基础上，进行基于最小深度(MD)的随机生存森林(RSF)分析，进一步缩小基因列表。RSF分析重复1000次，6个一致指数(C-index)值最大的基因被认为是最终候选基因。
其由4个敏感基因(JAK1、NFKB2、PPP6C和TNFRSF1B)和2个耐药基因(PIGM和TPR)组成。然后，将四个敏感基因和两个耐药基因的平均表达差异定义为CRISPR筛选的肿瘤固有免疫评分，CTIS越高，表明抗肿瘤免疫反应越强。在训练数据集和验证数据集合中，CTIS显示出较好的预后价值，更高的CTIS与更好的生存结局相关(图5B-C)。
此外，研究者将CTIS特征与其他14个已发表的特征进行综合比较。CD8、CYT等多种特征之间高度相关(图5D)。相比之下，CTIS特征与其他特征的相关性相对较弱，表明它具有补充作用而不是替代作用。CTIS预测的整体效果较好，平均AUC值为0.620(图5E)。
研究者进一步计算来自TCGA泛癌treatment-naïve T数据中的CTIS，以表征CTIS在不同癌症类型和免疫亚型中的分布。在6种免疫亚型中，C5的CTIS评分最低，符合其特征。
图5. 构建CTIS预测免疫治疗响应
9.确定潜在的OGs/TSGs调控网络
致癌基因(OGs)或抑癌基因(TSGs)可能参与肿瘤免疫调控。因此，研究者认为构建敏感基因和耐药基因的OGs/TSGs调控网络可以揭示敏感基因和耐药基因失调的潜在机制。OGs和TSGs的列表由OncoKB获得，对于OGs，功能相关的事件被视为激活(0=不激活;1 =激活)。对于TSGs，功能相关的事件被认为是失活的(0=非失活;1 =失活)。研究者假设当敏感基因的表达在OG激活/TSG失活后显著下调时，敏感基因与OGs/TSG之间存在关联；相应地，当耐药基因的表达在OG激活/TSG失活后显著上调时，发现电阻与OGs/TSG之间存在关联。敏感/耐药基因和OGs/TSGs之间共有159种显著关联(图6A)。有趣的是，研究者发现敏感基因倾向于与TSGs有更多的关联(66.7%)，而耐药基因则与OGs有更多的关联(86.4%)(图6B)。具有显著相关性的OGs/TSGs被定义为肿瘤免疫相关的OGs/TSGs。
10.预测免疫疗法的组合用药
癌症免疫治疗的一个主要挑战是提高肿瘤对ICB治疗的响应。以往的实验和临床研究表明，组合治疗策略可以显著增加应答病例的百分比，并有助于显著的生存获益。研究者采用一种药物预测的特征匹配方法，以识别更多与免疫疗法协同的潜在联合伙伴(图6C)。由于查询特征是该方法的基础，首先收集可能与免疫治疗相关的基因来进行药物检索，获得另外5个经ICB处理的筛选数据。这些数据使用的实验设计不同于ICB-naïve筛查，而是将免疫治疗干预引入到实验中。因此，这些筛选可以识别可能介导ICB抗性或敏感性的潜在调控因子。随后，研究者将敏感基因、肿瘤免疫相关TSGs、ICB增强基因整合到一个meta基因列表中，该列表中的基因被称为positive调节因子。从理论上讲，增强这些基因的功能可能与增强抗肿瘤免疫反应有关。negative调节因子与之相反 (图6C)。另外，从CMap数据集中获得药物诱导后基因的表达变化。为确保该研究结果易于临床转化，研究者只选择已经批准或已经通过I期和II期临床试验的药物进行后续分析。研究者分别采用3种方法将查询特征与药物特征进行匹配，并利用基于顺序统计量的方法对这些结果进行整合，得到稳健的药物预测结果(图6C-D)。在排名前10位的药物中，有4个候选药物都有过与免疫治疗组合用药的实验或临床研究报道，进一步证明预测的可靠性。
图6. 预测免疫疗法的组合用药
CRISPR技术和免疫治疗热点的碰撞，是不是迸发出不一样的火花呢？今天的文章没有用到很复杂的算法和大量的生物实验，但胜在新意和思路。同时结合CRISPR技术和免疫治疗两大热点研究方向，对大量遗传筛选-免疫响应相关数据集进行整理分析，挖掘免疫治疗潜在调控因子，并构建免疫治疗响应预测特征和预测免疫治疗组合用药方案。整份工作由大量的生信分析和少量生物实验完成，“性价比”极高，谁叫生物实验贵，耗时长 ，失败率还高呢。
另外，小编还想和大家分享一个CRISPR技术相关的宝藏数据库，肿瘤依赖性图谱计划（Cancer Dependency Map，简称DepMap，https://depmap.org/portal/，图7）。
图7. DepMap
DepMap项目是由Broad Institute与Sanger研究所进行战略合作的一部分，该网站每个季度更新一次，速度快，时效有保证。通过该网站，研究者能够分析broad institue和其他多个来源的数据，数据量非常丰富，包括 CCLE的多组学数据、broad项目（Achilles的基因依赖数据、PRISM的小分子敏感性数据、CTD）、Novart项目（drive）、sanger项目（Score和GDSC）和Gygi实验室的质谱定量蛋白质组学数据。
在21Q4的数据中，研究者对不同来源的CRISPR数据和RNA干扰数据进行整合，并提供其相应细胞系的突变，表达等多维组学信息（图8），非常好用！
图8. DepMap数据
最后的最后，如果各位想对DepMap或者CRISPR数据的使用有更多的兴趣和疑问，不妨看看由Mathew J. Garnett和Kosuke Yusa领衔的Wellcome Sanger Institute团队的这篇文章吧（图9）[2]，该工作利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在30个癌种的324种癌细胞系中分别敲掉18,009个基因，首次实现从基因组规模的水平上，以数据驱动的方式，寻找有效的抗癌靶点。正是CRISPR技术的开发和应用让癌细胞彻底暴露自己的弱点，数千个癌细胞生长不可或缺的基因被发现，其中628个基因是非常有潜力的抗癌靶点。
图9. CRISPR-Cas9优化癌症治疗靶点
好啦，各位小伙伴，今天的内容就是这些，我们下次再见啦。
内容过硬的单细胞和常规联合分析 - 简书 (jianshu.com)
PANoptosis研究潜力：nature文章解析 - 简书 (jianshu.com)
参考文献：
1. Integrative analysis of CRISPR screening data uncovers new opportunities for optimizing cancer immunotherapy
2. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR Cas9 screens
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