靶向GPC3的CAR-T细胞对有细胞因子释放综合征（CRS）风险的肝细胞癌患者的治疗初显成效。几种采用天然TCR信号传导的T细胞过继疗法（ACT）在实体肿瘤中诱导了更有效的抗肿瘤功能，并减少了相对于CAR的细胞因子产生。
该研究构建的sFv-ε T细胞在减少细胞因子释放的同时显示出良好的抗肿瘤效果。RNA-seq分析发现这可能与钙-钙调磷酸酶-NFAT信号通路活性较低有关。此外，研究进一步构建GPC3特异性7sFv-ε T细胞，并在临床前小鼠模型中评估了其抗肿瘤活性，揭示了GPC3特异性7sFv-ε T细胞在实体肿瘤治疗中的潜力。
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发表时间：2022-04-19
发表期刊：Molecular Therapy – Oncolytics（IF=7.2）
关键词：GPC3；嵌合sFv-CD3ε受体；IL-7；免疫疗法；实体肿瘤；RNA-seq
研究对象：小鼠
研究方法：RNA-seq、流式细胞术、免疫组化等
DOI：10.1016/j.omto.2022.04.003.
研究背景
靶向GPC3的CAR-T细胞对有细胞因子释放综合征（CRS）风险的肝细胞癌患者的治疗初显成效。几种采用天然TCR信号传导的T细胞过继疗法（ACT）在实体肿瘤中诱导了更有效的抗肿瘤功能，并减少了相对于CAR的细胞因子产生。为了提高靶向GPC3的ACT的有效性和安全性，研究用与CD3ε连接的抗GPC3单链可变区片段（sFv）修饰T细胞，将其整合到整个TCR/CD3复合物中，形成嵌合sFv-CD3ε受体（sFv-ε）。发现sFv-ε T细胞在减少细胞因子产生的同时显示出良好的抗肿瘤活性，RNA-seq分析发现这可能与钙-钙调磷酸酶-NFAT信号通路活性较低有关。研究进一步构建了IL-7共表达的小鼠sFv-ε T细胞（7sFv-ε），发现在具有免疫功能的小鼠模型中，与传统的sFv-ε T细胞相比，7sFv-ε T细胞表现出更强的持久性、抗肿瘤疗效和免疫记忆性，同时，保留了与CRS相关的低细胞因子的产生。这些结果表明，GPC3特异性7sFv-ε T细胞可能是一种潜在实体肿瘤治疗策略。
研究思路
研究结果
1. 与CAR-T细胞相比，人sFv-ε T细胞具有自激活减轻的TCR样信号传导
为了探究sFv-ε是否可以介导TCR样信号，用原代人T细胞制备的抗GPC3 sFv-ε T或CAR-T细胞。未转导（UTD）T细胞做为对照，评估被GPC3肽激活时sFv-ε T或CAR-T细胞中关键TCR信号分子的磷酸化动力学和持续时间。接下来，研究者进一步分析了抗原非依赖性信号传导（tonic signaling）是否会促进T细胞分化和衰竭。结果表明，在抗原刺激下，sFv-ε可以诱导内源性CD3ζ的磷酸化，暗示sFv-ε可以通过整个TCR/CD3复合体转导抗原激活。此外，与CARs相比，sFv-ε显著减弱了抗原非依赖性信号（图1）。
图1 在人28ζ CAR、BBζ CAR和sFv-ε T细胞中激活、分化和抑制表型的不同特征
2、人sFv-ε T细胞在减少细胞因子产生的同时显示出良好的抗肿瘤效果
与CAR-T细胞治疗相关的CRS的特点是外周细胞因子升高，包括IL6、IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF。通过体外细胞因子释放实验发现，sFv-ε T细胞通常比CAR-T细胞诱导的IL6、IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF的分泌更少（图2B）。评估sFv-ε和CAR-T细胞在PLC/PRF/5荷瘤小鼠体内的抗肿瘤疗效（图2C）发现，在注射T细胞7天后与28ζ和BBζ CAR-T组相比，sFv-ε T组外周血中CD4+和CD8+T细胞的持久性增强（图2D）。sFv-ε T细胞在早期诱导肿瘤消退的程度优于CAR-T细胞（图2E）。在实验结束时，sFv-ε T细胞或BBζ CAR-T细胞比28ζ CAR-T细胞更有效地抑制肿瘤生长（图2F）。在另一项实验中，研究人员检测了接受了大量T细胞的荷瘤小鼠体内的细胞因子。与CAR-T细胞治疗的小鼠相比，sFv-ε T细胞治疗的小鼠外周血和肿瘤组织中存在人IFNγ、TNFα、IL2和小鼠IL6减少的趋势（图2G）。这些数据表明，人GPC3特异性sFv-ε T细胞在减少一些与CRS相关细胞因子产生的同时显示出与CAR-T细胞相比具有竞争力的抗肿瘤效果。
图2 人28ζ CAR、BBζ CAR和sFv-ε T细胞的抗肿瘤活性和细胞因子产生的特征
3、与CAR相比，sFv-ε介导的钙-钙调磷酸酶-NFAT信号活性较低
为探究sFv-ε或CAR信号通路对细胞因子转录的调节是否不同，对受高水平GPC3肽刺激的T细胞进行RNA-seq。如图3C所示，与28ζ或BBζ CAR-T细胞相比，sFv-ε T细胞中许多NFAT调节的细胞因子的mRNA表达水平降低，包括IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF。钙/钙调磷酸酶/NFAT网络在细胞因子的产生中起着重要作用。细胞内Ca2+的增加导致钙调磷酸酶的快速激活，导致NFAT去磷酸化、核易位和随之而来的基因转录。此外，钙调磷酸酶抑制剂FK506几乎完全消除了所有工程T细胞产生IFNγ、TNFα和IL2，表明这些细胞因子主要受钙调磷酸酶-NFAT通路调控（图3B）。基因集富集分析（GSEA）显示，钙离子转运在sFv-ε T细胞中的正调控活性低于CAR-T细胞（图3D）。因此，研究进一步分析了人sFv-ε细胞和CAR-T细胞与PLC/PRF/5细胞共培养后细胞内Ca2+水平。sFv-ε T细胞中Ca2+的增加幅度和持续时间均低于CAR-T细胞（图3E）。这些发现表明，sFv-ε T细胞中钙-钙调磷酸酶-NFAT通路的活性低于CAR-T细胞，这可能有助于减少IFNγ、TNFα和IL2的产生。
图3 sFv-ε或CAR介导的钙-钙调磷酸酶-NFAT信号通路的特征
4、IL7共表达可提高小鼠7sFv-ε T细胞的体外存活率
为了提高T细胞的存活率和免疫记忆，通过将sFv-ε和IL7与一个2A肽序列融合，构建了小鼠sFv-ε，共表达IL7（图4A）。用各自的逆转录病毒转导C57BL/6小鼠的脾T细胞，生成sFv-ε、7sFv-ε或CAR T细胞。分析小鼠T细胞的记忆分化和衰竭表型发现sFv-ε和7sFv-εT细胞的CD44+CD62L+中枢记忆性T细胞比例高于28ζ和BBζ CAR T细胞（图4C和图4D），与CAR T细胞相比，sFv-ε和7sFv-εT细胞的PD-1和LAG-3表达显著降低（图4E和图4F）。为了评估T细胞对IL2缺乏诱导凋亡的易感性，在没有加入IL2的情况下，T细胞孵育24小时。与预期相符，7sFv-εT细胞的凋亡率显著低于其他工程T细胞（图4G和图4H）。利用Western blot分析细胞凋亡相关蛋白的表达，结果表明，与其他工程T细胞相比，7sFv-ε T细胞降低了caspase 3的活化，同时上调表达了抗凋亡的Mcl-1、Bcl-xL和Survivin（图4I）。此外，在低浓度IL2的体外培养条件下，7sFv-ε T细胞比传统的sFv-ε T细胞具有更强的增殖能力。
图4 IL7对小鼠7sFv-ε T细胞的体外作用
5、7sFv-εT细胞显示出良好的体内抗肿瘤效果
小鼠工程T细胞的体内抗肿瘤活性首次在Hepa 1-6-GPC3模型中评估，该模型具有免疫应答特性（图5C）。传统的sfv-ε和28Z CAR T细胞抑制肿瘤生长和延长小鼠存活时间，而BBζ CAR T细胞在6只小鼠中的3只里更早失去抑制肿瘤生长的能力。与其他工程T细胞相比，7sFv-εT细胞在治疗40天后在6只小鼠中的4只里完全根除了肿瘤，并显著提高了小鼠的存活率（图5D和图5E）。而进一步用原位E0771-GPC3模型评估发现传统的SFV-εT细胞和CAR T细胞无法控制肿瘤的进展，然而7sFv-εT细胞仍表现出比其他细胞更快的抗肿瘤作用，并最终几乎完全消除肿瘤（图5G和图5H）。在Hepa 1-6-GPC3模型中检测细胞因子的释放，发现在外周血中，sFv-ε和7sFv-εT细胞比BBζ CAR T细胞产生或诱导更低水平的IFNγ、TNFα 和 IL6。而在肿瘤组织里，与CAR T细胞相比，上述两种细胞具有产生更少IFNγ和TNFα的趋势（图5I）。结果表明，sFv-ε和7sFv-ε T细胞与CAR-T细胞相比，可能降低免疫活性宿主的CRS风险。
图5 小鼠28ζ CAR、BBζ CAR、sFv-ε和7sFv-ε T细胞的抗肿瘤活性和细胞因子产生的特性
6.IL7的共表达提高了小鼠7sFv-εT细胞的持久性，并在体内诱导了免疫记忆
为了阐明7sFv-ε T细胞抗肿瘤能力增强的机制，研究了T细胞在Hepa 1-6-GPC3模型中的持久性。如图6A和6B所示，7sFv-ε和28ζ CAR-T组比sFv-ε和BBζ CAR-T组有更多的CD4+ T细胞。7sFv-ε T细胞增加了CD8+ T细胞和9F2+ T细胞的积累，其次是sFv-ε，28ζ CAR-T和BBζ CAR-T细胞。7sFv-ε T细胞组的转导基因拷贝数显著高于其他T细胞工程组（图6C）。此外，7sFv-ε T细胞组的肿瘤浸润CD8+细胞颗粒酶B表达升高，表明其抗肿瘤的细胞溶解能力增强（图6D）。7sFv-ε T细胞处理的小鼠脾脏中9F2+ T细胞存活率最高（图6E）。鉴于这些发现，7sFv-ε T细胞抗肿瘤能力的提高应该至少部分归因于输入的T细胞的持久性增加。在用7sFv-ε T细胞去除原发肿瘤后，在小鼠的两侧胁腹重新注射Hepa 1-6-GPC3细胞（图6J）。7sFv-ε T细胞处理组小鼠与对照组比较表明，在持续4周以上的全部6只小鼠中，肿瘤均立即消除，这表明7sFv-ε T细胞治疗可以提供长期保护，防止肿瘤复发（图6K）。
图6 7sFv-ε T细胞治疗提高了T细胞的持久性和免疫记忆
研究结论
sFv-ε可以显著降低相对于CARs的T细胞自激活，并介导抗原特异性TCR样信号。与28ζ和BBζ CAR-T细胞相比，人类和小鼠的传统sFv-ε T细胞在减少细胞因子产生的同时表现出相同或更强的抗肿瘤疗效。GPC3特异性7sFv-ε T细胞进一步提高了抗肿瘤免疫功能，同时保留了CRS相关细胞因子的低产量，提示它可能是一种有效、安全的实体肿瘤治疗策略。
参考文献：
Yansha Sun, Yiwei Dong, Ruixin Sun, Yifan Liu, Yi Wang, Hong Luo, Bizhi Shi, Hua Jiang, Zonghai Li,Chimeric anti-GPC3 sFv-CD3ε receptor-modified T cells with IL7 co-expression for the treatment of solid tumors,Molecular Therapy - Oncolytics,Volume 25,2022,Pages 160-173,ISSN 2372-7705,https://doi.org/10.1016/j.omto.2022.04.003.
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